未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答與胃癌發(fā)生的關(guān)系.pdf_第1頁
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1、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士研究生畢業(yè)論文1第一部分第一部分無血清誘導(dǎo)下胃癌AGS細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期變化無血清誘導(dǎo)下胃癌AGS細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期變化引言引言內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum,ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的膜性細(xì)胞器,是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后折疊、聚集的場所,是調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞鈣水平的場所,也是膽固醇、類固醇及許多脂質(zhì)合成的場所。在真核生物細(xì)胞中不僅具有蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成、物質(zhì)運輸、信息儲存及傳遞功能、還具有

2、機械支持、糖類代謝和解毒作用。在蛋白質(zhì)折疊過程中,由于各種原因會使得未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白增多。然而,在細(xì)胞內(nèi)存在一種機制,這一機制可以通過調(diào)整內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的數(shù)量和加強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力,來減少未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的進(jìn)一步生成,緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力,即未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse,UPR)[1]。UPR通過相關(guān)感受器發(fā)出一系列的調(diào)節(jié)信號用以提高ER的折疊能力,加快錯誤折疊或未折疊蛋白的降解,限制mRNA

3、翻譯速度以減輕客戶蛋白負(fù)荷。近來研究發(fā)現(xiàn)UPR可用于保持ER內(nèi)穩(wěn)態(tài)和阻止細(xì)胞凋亡,這一機制可能是多種疾病的病原學(xué)基礎(chǔ)過多ER應(yīng)激因子可能會影響蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的折疊,引發(fā)氧化應(yīng)激,活化各種細(xì)胞凋亡通路[24]。腫瘤細(xì)胞最顯著的特征是生長失控和不分化,各種原因?qū)е录?xì)胞周期調(diào)控的失衡會使細(xì)胞生長失控而出現(xiàn)腫瘤,無血清饑餓是一種特殊的實驗條件,本研究擬采用無血清培養(yǎng)基作為ER的應(yīng)激條件,觀察胃癌AGS細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的

4、變化。1.1材料1.1.1細(xì)胞株1.1材料1.1.1細(xì)胞株人胃腺癌細(xì)胞(humangastricadenocarcinoma,AGS.ATCCCRL1739),為本室保存。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士研究生畢業(yè)論文3管,保留。(2)加0.05%胰酶1mL洗板,37℃培養(yǎng)箱2~3min,吸取胰酶液于相應(yīng)的10mL試管中,重復(fù)3次,鏡下觀察消化效果。(3)將上述收集的10mL試管中的上清液倒入相應(yīng)的孔中,中止消化。(4)收集上述細(xì)胞于相應(yīng)的10m

5、L試管中4℃1500rpm離心5min。(5)倒去上清,加2~5mL1PBS,輕輕懸浮細(xì)胞,4℃1500rpm離心5min洗滌一次。(6)倒去上清,加1.5mL1PBS輕輕懸浮細(xì)胞。(7)2mL冰無水乙醇(其中1mL邊搖邊加,再加1mL)。(8)4℃冰箱保存。1.2.2.2碘化丙錠(propidiumiodide,PI)的染色程序:1.2.2.2碘化丙錠(propidiumiodide,PI)的染色程序:(1)取1mL無水乙醇保存的細(xì)胞

6、懸液,用1PBS離心洗滌二次。(2)調(diào)整細(xì)胞濃度為5105細(xì)胞mL。(3)離心棄上清液后,余200μL,加100~200μL1%RNA酶37℃水浴30min。(4)加入100μLPI染色液(250μgmL)至終濃度50μgmLPI,37℃水浴20min。(5)用350目尼龍網(wǎng)過濾后上機檢測。(6)以PI熒光讀數(shù)為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),在FCM上計數(shù)細(xì)胞周期各期的細(xì)胞數(shù)目。1.2.3統(tǒng)計學(xué)方法1.2.3統(tǒng)計學(xué)方法全部統(tǒng)計數(shù)據(jù)用SAS8e

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