內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性分析.pdf

1、背景： 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是當(dāng)今威脅人類健康的主要疾病之一，冠心病是多種遺傳因素和環(huán)境因素相互作用所致的多基因疾病，年齡、高血壓、吸煙、肥胖等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素已廣為人知。近年來，冠心病相關(guān)基因的定位和識(shí)別成為研究的熱點(diǎn)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因已被列入冠心病研究的備選基因。 一氧化氮(NO)是細(xì)胞的一種重要生物活性介質(zhì)，幾乎參與各種疾病的病理生理過程，也是冠心病的發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。一氧化氮合酶是體

2、內(nèi)NO水平及其生成的唯一限速酶，其活性與遺傳有關(guān)。生理狀態(tài)下主要由內(nèi)皮型(eNOS)調(diào)節(jié)NO的持續(xù)生成。 NO水平與內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因的多態(tài)性密切相關(guān)。人eNOS基因編碼1203個(gè)氨基酸，定位于染色體7q35-q36，全長(zhǎng)21～22kb，包括25個(gè)內(nèi)含子和26個(gè)外顯子。eNOS基因存在多種多態(tài)性，其中G894T多態(tài)性與冠心病關(guān)系密切，G894T多態(tài)性可導(dǎo)致所編碼的氨基酸Glu298Asp多態(tài)性。結(jié)構(gòu)決定功能，Glu298As

3、p多態(tài)性可能就意味著eNOS功能多態(tài)性，導(dǎo)致eNOS活性降低，NO水平下降，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。本研究旨在探討內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因(eNOS)G8941、多態(tài)性與冠心病的關(guān)系，并初步了解傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素、遺傳因素在冠心病發(fā)生、發(fā)展中的作用。 研究對(duì)象： 冠心病組：196例冠心病患者選自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，符合世界衛(wèi)生組織(WHO)關(guān)于缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有患者經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)。 對(duì)照組：

4、189例非冠心病組人群選自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科冠狀動(dòng)脈造影陰性或未達(dá)到冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者。 本研究人群個(gè)體之間無血緣關(guān)系，均為漢族人。 研究方法： 冠狀動(dòng)脈病變的評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)時(shí)，以左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈及主要分支中任何一支血管狹窄程度≥50％為陽性。并根據(jù)累及支數(shù)定義為單支、雙支和三支病變，累及左主干者記作雙支病變，統(tǒng)計(jì)病變血管支數(shù)。 基因組DNA抽提和eNOS G894T基

5、因多態(tài)性檢測(cè) 1.白細(xì)胞基因組DNA抽提：酚／氯仿法提取外周血白細(xì)胞DNA。 2.eNOS G894T基因多態(tài)性檢測(cè)：采用PCR-RFLP技術(shù)。上游引物：5’-CATGAGGCTCAGCCCCAGAA C-3’下游引物：5’-AGTCAATCCCTTTGGTGC TCAC-3。PCR反應(yīng)體系共25μl，PCR反應(yīng)體系共25ul：10×PCR緩沖液2.5ul，樣本DNA 2.5ul，Taq DNA聚合酶0.25ul(1u)

6、，dNTP 0.5ul，MgCl21.5ul，引物終濃度均為0.5umol／L。擴(kuò)增條件：在PCR儀上擴(kuò)增，95℃預(yù)變性5分鐘，95°C變性45秒，60°C退火45秒，72°C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)后72°C終末延伸5分。PCR產(chǎn)物以2％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5ug／ml)電泳，以85V電泳30分鐘，UA凝膠成像儀上觀察是否有PCR產(chǎn)物并攝影保存。酶切反應(yīng)：取PCR產(chǎn)物10ul，Mob I內(nèi)切酶10U，10×酶切緩沖液2ul，反應(yīng)

7、總體積25ul。在37°C水浴16小時(shí)，一旦第894位點(diǎn)出現(xiàn)G→T，206bp的PCR產(chǎn)物就會(huì)被切割為119bp和87 bp的片斷。酶切產(chǎn)物以2％瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5ug／ml)電泳，以85V電泳30分鐘，UA凝膠成像儀上觀察并攝影保存。 統(tǒng)計(jì)分析以直接計(jì)數(shù)法計(jì)算冠心病組患者和對(duì)照組的基因型和等位基因頻率，組間比較采用x2檢驗(yàn)。資料分析應(yīng)用SPSS 10.0軟件包作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。遺傳平衡吻合度x2檢驗(yàn)群體基因型分布是否符合

8、Hardy-weinberg平衡定律。計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，組間均數(shù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異用t檢驗(yàn)，各組基因型和等位基因頻率之間的比較用x2檢驗(yàn)，相對(duì)危險(xiǎn)度以比值比(OR)的95％的可信區(qū)間(95％CI)來表示，pO．05

9、)。 2.冠心病組基因型分布及基因突變頻數(shù)明顯高于對(duì)照組，冠心病組吸煙者與對(duì)照組對(duì)比差異更明顯，x2檢驗(yàn)結(jié)果分別為：x2=7.97，p<0.01和x2=10.58，p<0.01。 3.吸煙者與非吸煙者基因型分布及等位基因頻率比較x2分別為5.82、5.77，p值均小于0.05。 4.GT+TT基因型分布在冠心病單支病變組與雙支+三支病變組無顯著差異；在冠心病吸煙者中表現(xiàn)出顯著差異，x2=6.48，p<0.05。

10、 5.冠心病組吸煙合并高血壓病者與吸煙的無高血壓病者等位基因頻率比較x2=4.36，p<0.05。 6.冠心病單支病變組GT+TT／GG為11／61與雙支+三支病變組的33／91比較，x2=3.36，p>0.05；而冠心病吸煙者x2=6.48，p<0.05；冠心病吸煙組中伴高血壓病組x2=4.354，p<0.05?；蝾l率分布對(duì)比結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.浙江地區(qū)漢族人群中存在G894T基因多態(tài)性。