GADD45基因表達(dá)作為生物劑量計(jì)的可行性研究.pdf

1、為了研究GADD45基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化和受照劑量之間的關(guān)系,該實(shí)驗(yàn)選取健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄半定量PCR的實(shí)驗(yàn)方法,測(cè)定該基因mRNA的相對(duì)量.首先根據(jù)文獻(xiàn)選擇特異性引物,在genbank上進(jìn)行核實(shí),擴(kuò)增GADD45基因片段.選擇在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的β-actin為內(nèi)參,合成引物序列并與GADD45進(jìn)行同管擴(kuò)增,產(chǎn)物電泳后在凝膠成像儀上用PCR分析軟件分析條帶的灰度及密度等因素,兩者比值(GADD45/β-act

2、in)表示GADD45基因的相對(duì)量.將100ml健康獻(xiàn)血員外周血平均置于6個(gè)40ml培養(yǎng)瓶中,分別給予0、1、2、3、4、5Gy X射線照射,提取單個(gè)核細(xì)胞,加入含10﹪胎牛血清的1640液后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在培養(yǎng)0h、4h、8h、16h、20h和24h的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定GADD45基因的含量.實(shí)驗(yàn)采用6×6析因設(shè)計(jì),每交叉點(diǎn)重復(fù)測(cè)量4次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果(基因mRNA相對(duì)量)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SARS軟件分析數(shù)據(jù),比較照射后不同時(shí)

3、間點(diǎn)之間、不同照射劑量之間、以及不同照射劑量的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;作照射后各時(shí)間點(diǎn)GADD45表達(dá)量與照射劑量的直線相關(guān)分析;作不同照射劑量下GADD45表達(dá)量與照射后時(shí)間的非線性曲線擬合.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,照射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上GADD45基因表達(dá)量間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).觀察照射劑量與基因表達(dá)量的關(guān)系可看出,在所觀察的各時(shí)間點(diǎn)上,基因表達(dá)量隨照射劑量增加而增加,存在直線關(guān)系,得出直線回歸方程.觀察每個(gè)劑量組的基因表達(dá)量和

4、時(shí)程之間的關(guān)系,得出1-5Gy的5個(gè)劑量趨勢(shì)一致:照射后基因表達(dá)增加,在照后4小時(shí)GADD45基因相對(duì)量達(dá)最高峰,此后下降,在觀察到的最長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)上(24h)該基因量仍未降至初始水平.該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,X線照射可誘導(dǎo)GADD45基因表達(dá)照射隨劑量增加而增加,具有較好的線性關(guān)系.這與國(guó)內(nèi)外關(guān)于X線照射誘導(dǎo)G1期阻滯及相應(yīng)基因表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,也再次證明了作為P53下游基因的GADD45基因在輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞G1期阻滯中所起的重要作用.因