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文檔簡介
1、支氣管哮喘是一種免疫源性炎癥氣道疾病,以氣道平滑肌痙攣及漸進性氣道高反應為主要特點,其發(fā)病機制尚不完全清楚。近年來,神經源性炎癥越來越受到關注,但對于神經系統(tǒng)與這些炎癥過程復雜的相互作用了解甚少。最近研究表明神經生長因子(nerve growth factor,NGF)是一個重要介質。哮喘患者血清NGF水平增高,支氣管哮喘動物模型的研究結果顯示NGF能引起氣道高反應,外源性NGF可引起豚鼠對組胺的氣道高反應增加,應用NGF抗體可大大減少
2、哮喘引起的氣道高反應。近年來,本室的研究結果證實:NGF在哮喘豚鼠下呼吸道、肺內炎性細胞和感覺神經節(jié)等內臟感覺傳入部位過表達。 PBK/Akt既是PI3K的一個重要的下游調節(jié)激酶,在糖代謝、蛋白質合成、細胞抗凋亡過程中均起著重要的作用,但它又可不依賴于PI3K途徑而被NGF激活,NGF激活TrkA使其與SH2-B β結合,促使SH2-B β發(fā)生洛氨酸磷酸化,SH2-Bβ再作用于Akt/PKB,Akt/PKB進一步激活分插頭轉錄因
3、子,促使PC12細胞分化增殖。最近本室有研究提示,Akt/PKB很可能參與了哮喘發(fā)病機制中NGF介導的信號傳導通路但它如何參與哮喘調節(jié)的機制尚不十分清楚。 有研究顯示,哮喘發(fā)作期和緩解期患者血清IL-1β水平明顯高于對照組;鼠哮喘模型肺組織及C7-T5節(jié)段脊神經和相應節(jié)段脊髓后角IL-1 β mRNA和肺泡灌洗液中IL-1β水平均明顯升高。前炎癥因子IL-1β可上調氣道上皮細胞TGF-β 1mRNA表達,從而對氣道上皮的損傷進行
4、修復,當過度調節(jié)后可導致氣道重塑。白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)能明顯減少肺部嗜酸性粒細胞浸潤,降血清、肺泡灌洗液中ECP水平及血清中IL-5的含量,促進嗜酸性細胞凋亡。這都提示著IL-1β在哮喘發(fā)病中有著重要作用,但是IL-1 β是否參與了Akt/PKB調節(jié)的哮喘發(fā)病機制,是一個值得探討的問題。 血管內皮生長因子(VEGF)屬于血小板源生長因子家族,是由兩個相同多肽鏈通過二硫鍵形成的同源二聚體糖蛋白。多種細胞可分泌V
5、EGF,特異性作用于內皮細胞,調節(jié)內皮細胞有絲分裂,增加血管通透性和血管緊張性,還可促進胚胎期血管形成。有研究顯示,哮喘模型大鼠肺組織中VEGF及其受體Flk-1表達上調,并與氣道平滑肌增殖有密切關系,該結果提示VEGF及其受體可能參與了哮喘氣道重建中氣道平滑肌增殖的過程。王修珍等也證明了白三烯受體拮抗劑可以降低哮喘豚鼠肺組織VEGF表達水平,從而減少血管增生,延緩哮喘氣道重塑的發(fā)生。還有實驗提示地塞米松可能通過降低VEGF,糾正血管生
6、成促進因子/抑制因子比例失衡部分地抑制氣道血管生成,延緩氣道重塑,這都提示著VEGF在哮喘發(fā)病中有著重要作用,Akt/PKB作為維持細胞存活的一個重要蛋白,極有可能參與了新血管的形成過程,但目前還沒有相關文獻報道,本研究旨在探討在哮喘中Akt/PKB與VEGF的關系。 本文利用免疫組織化學和Western blot方法,觀察在PKB/Akt被阻斷后,哮喘小鼠肺組織內VEGF、IL-1 β以及內臟感覺傳入部位IL-1 β表達的影響
7、,探討PKB/Akt蛋白是否通過調節(jié)炎性因子IL-1 β以及血管內皮生長因子VDGF參與哮喘發(fā)病機制的調節(jié)。通過這些問題的解決,我們將進一步清楚哮喘發(fā)病的信號轉導機制,為尋找新的治療方法提供理論依據。 材料和方法 一、實驗材料 1、實驗動物 本研究采用雌性BALB/c小鼠30只,由首都醫(yī)科大學實驗動物中心提供,均為雌性,體重在18~25g。 2、主要試劑 兔抗小鼠IL-1β抗體,兔抗小鼠V
8、EGF抗體均購于武漢博士德試劑公司;辣根過氧化物酶結合羊抗兔免疫球蛋白和SABC法免疫組化試劑盒均購于武漢博士德試劑公司;β-actin,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二次抗體,FITC標記的山羊抗兔二次抗體均購于北京中山公司; 3、主要儀器 AniRes動物肺功能分析系統(tǒng);RES1030信號調理器;電熱恒溫干燥箱;電子分析天平;恒溫水浴箱:低溫冷凍離心機;紫外分光光度計;通用電泳儀;轉印儀;正置熒光顯微鏡;-80度深低溫
9、冰箱:恒溫冰凍切片機;Motic Images Advanced3.2圖象分析系統(tǒng); 二、實驗方法 1、制備哮喘模型 腹腔注射卵蛋白致敏BABL/C小鼠,霧化吸入卵蛋白激發(fā)致喘。 2、免疫組織化學檢測 各組小鼠肺組織VEGF和IL-1β的表達,檢測C7-T5節(jié)段脊神經和相應節(jié)段脊髓后角IL-1β的表達。 3、Western blot方法 檢測各組小鼠肺組織VEGF和IL-1β的表達
10、,檢測C7-T5節(jié)段脊神經IL-1β的表達。 4、圖象分析 Western blot結果用Chemi Imager5500V2.03軟件掃描,用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的IDV值。免疫組化結果用Motic Images Advanced 3.2實時圖象分析系統(tǒng)采集照片并進行定量分析。 5、統(tǒng)計學處理 所有數值均以均數±標準差表示,實驗數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,組間比較進
11、行t檢驗。 實驗結果: 一、IL-1β 免疫組織化學結果顯示:哮喘組肺、C7-T5段脊神經節(jié)和相應節(jié)段脊髓后角IL-1β陽性產物的平均光密度值(MOD)顯著高于生理鹽水組(P<0.01);而PKB/Akt阻斷組與哮喘組相比,肺組織及C7-T5節(jié)段脊神經和相應節(jié)段脊髓后角內IL-1β陽性反應產物的平均光密度值明顯降低(P<0.05)。 Western blot結果顯示:與生理鹽水組比較,哮喘組小鼠肺、C7~
12、T5段脊神經中IL-1β目標帶的IDV(integrated density value)與內參照IDV的比值均明顯升高(P<0.01),而PKB/Akt阻斷組上述部位樣品中IL-1β目標帶的IDV與內參照IDV的比值均明顯低于哮喘組(P<0.05). 二、VEGF 免疫熒光結果顯示:哮喘組肺組織內VEGF陽性產物的平均光密度值(MOD)顯著高于正常對照組(P<0.01);而PKB/Akt阻斷組與哮喘組相比,上述部位VE
13、GF陽性反應產物的MOD值明顯降低(P<0.05)。 Western blot結果顯示:與正常對照組比較,哮喘組小鼠肺組織內VEGF的IDV(inte grated density value)與內參照IDV的比值均明顯升高(P<0.01),而PKB/Akt阻斷組上述部位樣品中IL-1β目標帶的IDV與內參照IDV的比值均明顯低于哮喘組(P<0.05). 討論 IL-1曾稱為淋巴細胞活化因子,在哮喘發(fā)病中起著重要
14、作用。有研究顯示,哮喘發(fā)作期和緩解期患者血清IL-1β水平明顯高于對照組;前炎癥因子IL-1β可上調氣道上皮細胞TGF-β1 mRNA表達,從而對氣道上皮的損傷進行修復,當過度調節(jié)后可導致氣道重塑。白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)能明顯減少肺部嗜酸性粒細胞浸潤,降血清、肺泡灌洗液中ECP水平及血清中IL-5的含量,促進嗜酸性細胞凋亡。這都提示著IL-1β在哮喘發(fā)病中有著重要作用.在本實驗的研究中發(fā)現,哮喘組肺、C7-T5段脊神經
15、節(jié)和相應節(jié)段脊髓后角IL-1β陽性產物顯著高于正常對照組;而PKB/Akt阻斷組與哮喘組相比,上述部位IL-1β陽性反應產物明顯降低,提示Akt很可能通過調節(jié)IL-1β的表達來參與哮喘發(fā)病機制的調解。 多種細胞可分泌VEGF,特異性作用于內皮細胞,調節(jié)內皮細胞有絲分裂,增加血管通透性和血管緊張性,還可促進胚胎期血管形成。有研究顯示,哮喘模型大鼠肺組織中VEGF及其受體Flk-1表達上調,并與氣道平滑肌增殖有密切關系,該結果提示V
16、EGF及其受體2可能參與了哮喘氣道重建中氣道平滑肌增殖的過程。王修珍等[2]也證明了白三烯受體拮抗劑可以降低哮喘豚鼠肺組織VEGF表達水平,從而減少血管增生,延緩哮喘氣道重塑的發(fā)生。這都提示著VEGF在哮喘發(fā)病中有著重要作用。本實驗研究證明,哮喘組肺組織內VEGF陽性產物顯著高于正常對照組;而PKB/Akt阻斷組與哮喘組相比,上述部位VEGF陽性反應產物明顯降低,提示Akt很可能通過調節(jié)VEGF的表達來參與哮喘發(fā)病機制的調解。本研究進一
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