IL-1α在沙眼衣原體感染Hela229細(xì)胞中的表達(dá)及穩(wěn)定表達(dá)IL-1α shRNA細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)是一種常見的、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體。Ct侵犯機(jī)體可引起泌尿生殖道感染，更為嚴(yán)重的是Ct感染與不孕、異位妊娠、宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌等疾病發(fā)生相關(guān)。Ct可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-1α、IL-6和TNF-α等多種炎癥因子，參與免疫應(yīng)答，其中IL-1α進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞因子（包括其自身、IL-6和IL-8等），參與Ct感染導(dǎo)致的組織損傷。因此，研究IL-1α在早期炎癥中的作用，為Ct感染的

2、發(fā)病機(jī)制、疾病預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:
　　 1、通過探討IL-1α在Ct感染HeLa229細(xì)胞前后，細(xì)胞內(nèi)、外IL-1α的表達(dá)情況，明確IL-1α在Ct感染細(xì)胞的炎癥早期的表達(dá)模式;
　　 2、構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IL-1α shRNA的細(xì)胞系，為后續(xù)研究Ct誘導(dǎo)炎癥機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)材料。
　　 方法:
　　 1、Ct感染Hela229細(xì)胞，吉姆薩染色后，光學(xué)顯微鏡觀察確定Ct包涵體，以建立C

3、t感染Hela229細(xì)胞的模型;
　　 2、用ELISA檢測(cè)IL-1α在Ct感染Hela229細(xì)胞內(nèi)以及培養(yǎng)上清中的表達(dá);
　　 3、利用基因克隆方法構(gòu)建IL-1α shRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela229細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IL-1αshRNA的細(xì)胞系;
　　 4、通過ELISA法檢測(cè)各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞IL-1α的表達(dá)，篩選出有效抑制內(nèi)源性IL-1α表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　 結(jié)果:

4、r>　　 1、光學(xué)顯微鏡示細(xì)胞內(nèi)的透明折光體為Ct的包涵體，表明Ct感染Hela229細(xì)胞模型已建立;
　　 2、Ct感染Hela229細(xì)胞36h，與未感染組相比，胞內(nèi)IL-1α明顯上升，有顯著差異（P＜0.05）;
　　 3、成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pRNAT6.1/Neo-siRNA1、2、3、4（4種IL-1αshRNA質(zhì)粒），經(jīng)DNA測(cè)序4種重組質(zhì)粒序列正確;
　　 4、透過熒光顯微鏡可見:90％以上穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)

5、胞有綠色熒光GFP表達(dá);
　　 5、Ct成功感染IL-1α shRNA穩(wěn)定細(xì)胞系，鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)未著色空洞即Ct包涵體，表明成功建立Ct感染各穩(wěn)定細(xì)胞系的模型;
　　 6、各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系（Ct感染組和TNF-α刺激組）中，psi4-IL-1α-Hela229細(xì)胞（IL-1α shRNA穩(wěn)定細(xì)胞系）胞內(nèi)IL-1α表達(dá)量顯著低于對(duì)照組psi-Neg-Hela229細(xì)胞(P＜0.05)。
　　 結(jié)論: