抗菌肽人β防御素3融合糖類結(jié)合域?qū)瘘S色葡萄球菌N315的抑制作用.pdf

1、目的：
　　探討化學(xué)合成和真核表達(dá)的抗菌肽人β防御素3融合糖類結(jié)合域(humanβdefensin3-carbohydrate-binding domain，hBD3-CBD)對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的抑制作用。
　　方法：
　　1、在化學(xué)合成的抗菌肽研究中，以直接殺菌實驗檢測抗菌肽hBD3、hBD3-CBD對MRSA

2、菌株N315的直接抑制作用和殺菌穩(wěn)定性；以微量肉湯稀釋法測定抗菌肽 hBD、融合抗菌肽 hBD-CBD對MRSA N315的最低抑菌濃度 minimum inhibitory concentration（MIC）以及抗菌肽作用于MRSA N315后對抗生素青霉素、四環(huán)素、頭孢拉定、利福平、萬古霉素、頭孢呋辛、氯霉素的MIC的影響。隨后，使用相同的微量肉湯稀釋法檢測抗菌肽作用于臨床 MRSA菌株之后，對抗生素青霉素、頭孢拉定和氯霉素的50

3、％ minimum inhibitory concentration（MIC50）和90%minimum inhibitory concentration（MIC90）的影響。
　　2、在真核表達(dá)的抗菌肽研究中，用重疊延伸剪接技術(shù)將抗菌肽和融合抗菌肽hBD3、hBD3-CBD1、hBD3-CBD2的基因序列克隆入真核表達(dá)載體pVAX1；以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)；通過逆轉(zhuǎn)錄-實時定量PCR、Wes

4、tern blot方法檢測抗菌肽基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)情況；通過MRSA N315感染后直接細(xì)菌計數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)上清液的IL-6濃度、延遲殺菌實驗來檢測抗菌肽真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞之后，對MRSA N315的抑制作用以及穩(wěn)定性。
　　結(jié)果：
　　1、直接殺菌作用顯示，抗菌肽hBD3以及hBD3-CBD對MRSA N315有顯著的抑制作用，hBD3-CBD的抑制作用強(qiáng)于hBD3；，hBD3-CBD抑制作用的穩(wěn)定性亦強(qiáng)于h

5、BD3。在最低抑菌濃度檢測中，抗菌肽hBD3以及hBD3-CBD對MRSA N315的最低抑菌濃度均為13.3±4.6?g/ml，兩者沒有顯著性差異。在MRSA N315的關(guān)鍵基因表達(dá)檢測中，hBD3-CBD對葡萄球菌的agrC和mecA基因表達(dá)有顯著抑制作用。抗菌肽作用于MRSA N315后，抗生素青霉素、頭孢拉定、萬古霉素、頭孢呋辛、氯霉素的MIC降低，抗生素四環(huán)素和利福平的MIC沒有變化?？咕淖饔糜贛RSA臨床菌株之后，使得頭孢

6、拉定、氯霉素的MIC50和MIC90顯著降低。
　　2、真核表達(dá)抗菌肽pVAX1/hBD3、pVAX1/hBD3-CBD1、pVAX1/hBD3-CBD2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后均有表達(dá)；感染后6和12小時，hBD3、hBD3-CBD1和hBD3-CBD2均顯示出對MRSA N315的殺菌活性；感染后12小時，hBD3-CBD1和hBD3-CBD2的殺菌活性優(yōu)于hBD3，hBD3-CBD1和hBD3-CBD2之間的殺菌活性

7、沒有差異；感染后6和12小時，hBD3、hBD3-CBD1、hBD3-CBD2的細(xì)胞上清液IL-6濃度顯著低于對照組，而hBD3-CBD1和hBD3-CBD2兩組之間的IL-6濃度未見差異。
　　結(jié)論：
　　融合抗菌肽hBD3-CBD對MRSA的殺菌作用和穩(wěn)定性優(yōu)于hBD3；真核表達(dá)抗菌肽hBD3、hBD3-CBD1和hBD3-CBD2對MRSA N315對HEK293T細(xì)胞的感染有顯著抑制作用，且 hBD3-CBD1和hB