人來源脂肪干細(xì)胞對小鼠隨意型皮瓣血管新生的影響.pdf

1、背景和目的：
　　脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離提取的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，對缺血性疾病的治療有積極作用，但相關(guān)機制的研究有待進(jìn)一步深入。本實驗?zāi)康脑谟谔剿骶植恳浦踩藖碓粗靖杉?xì)胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)對小鼠隨意型皮瓣成活能力及血管新生效應(yīng)的影響，分離培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞，用于小鼠隨意型皮瓣模型，觀察皮

2、瓣組織微血管數(shù)量、皮瓣成活率及細(xì)胞因子水平的變化，從脂肪干細(xì)胞旁分泌作用刺激血管新生的角度，探索脂肪干細(xì)胞輔助皮瓣移植的作用機制。
　　方法：
　　1、hADSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記:利用鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院健康成人吸脂術(shù)后的脂肪混懸液，采用Ⅰ型膠原酶消化法，體外分離、提取hADSCs，經(jīng)體外培養(yǎng)及傳代，于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，取第3代細(xì)胞運用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物進(jìn)行檢測。另取第3代細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨

3、分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，至第21d固定細(xì)胞并分別用油紅O或茜素紅對誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行染色，倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)結(jié)果。應(yīng)用CM-Dil熒光標(biāo)記第3代hADSCs，顯微鏡下觀察染色情況。
　　2、實驗動物與分組:清潔級(SPF)雌性4周齡小鼠30只，體重25-30g，按照隨機數(shù)字表法分為2組:實驗組（ADSCs組，n=15）于背部制備隨意型皮瓣并將500μl密度為1×106個/ml的細(xì)胞懸液分三次注射于皮瓣的蒂部、中部、遠(yuǎn)端;對照組（PBS組，

4、n=15）于背部制備隨意型皮瓣并將等量PBS同法注射于皮瓣的蒂部、中部、遠(yuǎn)端。
　　3、小鼠背部隨意型皮瓣模型的建立、細(xì)胞移植、標(biāo)本采集及檢測指標(biāo):于小鼠背部沿身體長軸方向設(shè)計蒂在顱側(cè)的隨意型皮瓣3cm×1.5cm，采用局部注射移植ADSCs;移植后7d，計算各組皮瓣成活率;移植后14d，取皮瓣組織，隨機作冰凍切片CD31免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察皮瓣組織微血管分布情況，并對CM-Dil標(biāo)記的ADSCs示蹤;ELISA法檢測皮

5、瓣組織中VEGF水平;Westernblot法檢測皮瓣組織中SDF-1水平。
　　4、統(tǒng)計學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSSStatistics17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗;以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、體外ADSCs分離、培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記:提取的ADSCs貼壁生長，呈梭形成纖維細(xì)胞樣，單層分布，均勻有序。流式細(xì)胞學(xué)檢查示第3代ADSCs表面抗原表達(dá)比例分別為CD

6、105（93.30±1.24）％、CD90（97.25±2.33）％、CD31(0.20±0.04)％、CD34(3.82±0.86)％、CD45(3.12±0.53)％、HLA-DR(0.81±0.09)％,同型對照均為陰性。成脂誘導(dǎo)21d后的ADSCs經(jīng)油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)可見成片分布的亮紅色圓泡，提示胞漿內(nèi)有脂滴形成。成骨誘導(dǎo)21d后的ADSCs經(jīng)茜素紅染色，可見島狀分布的橙紅色顆粒，提示有沉積的鈣結(jié)節(jié)。CM-DiI標(biāo)記后即刻觀察，

7、在熒光顯微鏡下見標(biāo)記后的ADSCs均顯紅色熒光，經(jīng)消化、重懸后細(xì)胞呈球形，胞漿豐富，活性良好，CM-Dil標(biāo)記陽性率大于90％。
　　2、皮瓣成活率比較情況:術(shù)后7d，成活皮瓣與壞死皮瓣間分界清晰，易被雙盲觀察者區(qū)別。實驗組皮瓣成活面積為（3.78±0.16）cm2，成活率為（84±3.625）％;對照組皮瓣成活面積為(2.27±0.16)cm2，成活率為（72.2±3.406）％;兩組皮瓣成活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0

8、5)。
　　3、皮瓣組織中微血管密度的檢測和CM-Dil熒光示蹤:和對照組相比，實驗組成活皮瓣內(nèi)微血管的密度有明顯的增加，實驗組為每單位面積內(nèi)（32.2±2.59）個，對照組為每單位面積內(nèi)（12.8±3.11）個，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。鏡下可見少量紅色熒光細(xì)胞分布于皮膚組織和皮下組織深層內(nèi)，未觀察到典型的紅色熒光與綠色熒光重疊現(xiàn)象。
　　4、皮瓣組織中細(xì)胞因子水平的檢測:ELISA檢測顯示實驗組和對照組

9、的皮瓣組織中均含有VEGF，與對照組相比，實驗組VEGF分泌量顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;Westernblot結(jié)果顯示，實驗組和對照組SDF-1表達(dá)均呈陽性，實驗組SDF-1蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、ADSCs可以通過Ⅰ型膠原酶消化法分離提取，該方法簡單、快捷，所提取到的細(xì)胞增殖能力強，具有多向分化潛能，基本符合ADSCs的特性。運用CM-Dil可以