rhEPO對糖尿病大鼠隨意皮瓣存活影響的實驗研究.pdf

1、目的：研究重組人促紅細胞生成素(rhEPO)對糖尿病大鼠超長隨意皮瓣存活的影響，探討其作用機制，為臨床上治療糖尿病病人皮瓣壞死提供一種新的思路和方法。
　　 方法：
　　 1、構造糖尿病模型大鼠:選取健康50只SD大鼠，隨機選取12只為健康對照組（A組），其余38只腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，55 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，飼養(yǎng)6周，最終的24只SD大鼠(空腹血糖＞200 mg/dL)為造模成功的糖尿病大鼠。

2、>　　 2、構建背部超長隨意皮瓣模型:將12只健康對照組大鼠（A組），24只糖尿病大鼠平均分成糖尿病EPO干預組（B組）、糖尿病對照組（C組），再次構建大鼠背部超長任意瓣模型(3cm×10 cm)，結扎皮瓣中包括皮瓣基底部的所有知名血管，徹底止血后，在皮瓣基底床墊入同樣大小無菌硅膠片，用無菌縫合線原位縫合，術后給予常規(guī)的抗炎、抗休克治療，立刻給予腹腔注射適量的生理鹽水及切口表面涂少量的紅霉素軟膏，成模后B組術后腹腔注射重組人促紅細胞生

3、成素(rhEPO)(5000 U/kg)，A組、C組腹腔注射等量生理鹽水。
　　 3、對皮瓣的情況觀察:每日觀察記錄皮瓣的狀況，包括皮瓣的色澤，組織質地、彈性。
　　 4、皮瓣成活率的統(tǒng)計:術后第10天，使用Nikon P310數(shù)碼相機拍照帶有刻度標記的照片，輸入計算機，用Image-Pro Plus v6.0軟件統(tǒng)計計算三組皮瓣的成活率(皮瓣成活率=皮瓣成活表面積/皮瓣總表面積×100％)。
　　 5、皮瓣的H

4、E染色組織學觀察:在三組SD大鼠皮瓣的壞死與存活的交界區(qū)域切取組織標本，浸泡于4％多聚甲醛溶液中，然后用石蠟包埋，制作成厚約3-4微米的切片，用于HE染色組織學觀察和免疫組化檢測。在低高倍鏡下觀察HE染色后切片，觀察組織的水腫、炎癥細胞的侵潤、壞死情況等。
　　 6、相關指標的免疫組化檢測:采用二步法進行免疫組化檢測VEGF、CD31表達，按VEGF、CD31免疫組化試劑盒的使用說明操作。每張片子選擇染色均勻的的區(qū)域，在400倍

5、的光鏡下觀察，隨機選擇5個視野拍攝保存，拍攝條件設置參數(shù)均一致。將保存的圖片導入Image-Pro Plus v6.0軟件，檢測VEGF陽性表達的累積吸光度值，作為評價VEGF表達的指標。低倍鏡下(100×)檢視每張切片表達棕褐色陽性顆粒CD31微血管染色分布，確定最高微血管染色區(qū)域，選擇5個最高微血管染色區(qū)域于高倍鏡下(400×)分別進行微血管記數(shù)，計算平均數(shù)。
　　 7、ELISA檢測每組大鼠血清中SDF-1α及MMP-9含

6、量:每只大鼠處死后立刻采取摘眼球法，收集5ml的血液，采好的血4℃保存30min，然后低溫(4℃)離心(3000r/min;15min)，約可獲得1-1.5ml的血清標本，分別按照MMP-9、SDF-1α ELISA試劑盒說明，采用雙抗體夾心法測定血清中的MMP-9、SDF-1α的含量，分別以ng/ml、pg/ml蛋白為其單位。
　　 結果：
　　 1、皮瓣情況觀察:術后第1天，三組皮瓣遠端均可見不同程度的腫脹、遠端灰紫

7、色，術后第5天，三組皮瓣尾端出現(xiàn)點狀的結痂，壞死跡象開始出現(xiàn)，術后第10天，三組皮瓣的尾端出現(xiàn)明顯的黑色痂殼，壞死區(qū)與存活區(qū)已可分辨出明顯的界限。
　　 2、皮瓣存活率:皮瓣面積C組(33.34±2.01)％明顯低于A(50.17±2.29)％組與B(48.3±2.43)％組(P＜0.01)，A、B組間無差異。
　　 3、皮瓣的組織學觀察:糖尿病對照皮瓣組（C組）較健康對照組（A組）皮下組織、肉膜組織、肌層組織明顯變薄，

8、血管密度低。糖尿病EP0干預組（B組）皮瓣組織水腫、血管擴張、炎癥細胞浸潤較輕，新生血管數(shù)量和肉芽組織增生程度上明顯優(yōu)于糖尿病對照組（C組）。
　　 4、免疫組化相關指標檢測:通過計算累積吸光度IOD值，VEGF表達量A組(4528.16±551.26)、B組(3671.67±482.04)明顯高于C組(2571.08±535.45)(P＜0.01)，A組與B組無差異。新生微血管計數(shù)B組(17.5±3.29)個/mm2明顯高于A

9、組(22.08±3.84)個/mm2，A、B組均明顯高于C組(11.33±2.42)個/mm2(P＜0.01)。
　　 5、ELISA相關指標檢測:采用雙抗體夾心法測定血清中的MMP-9、SDF-1α的含量，結果顯示血清中SDF-1α、MMP-9的含量A組、B組均明顯高于C組。
　　 結論：本實驗研究結果表明，促紅細胞生成素可能通過增加SDF-1α、MMP-9、VEGF表達等途徑促進皮瓣生血管增生，減輕炎癥反應，從而提高