rhEPO對(duì)糖尿病大鼠隨意皮瓣存活影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)糖尿病大鼠超長(zhǎng)隨意皮瓣存活的影響，探討其作用機(jī)制，為臨床上治療糖尿病病人皮瓣壞死提供一種新的思路和方法。
　　 方法：
　　 1、構(gòu)造糖尿病模型大鼠:選取健康50只SD大鼠，隨機(jī)選取12只為健康對(duì)照組（A組），其余38只腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，55 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，飼養(yǎng)6周，最終的24只SD大鼠(空腹血糖＞200 mg/dL)為造模成功的糖尿病大鼠。

2、>　　 2、構(gòu)建背部超長(zhǎng)隨意皮瓣模型:將12只健康對(duì)照組大鼠（A組），24只糖尿病大鼠平均分成糖尿病EPO干預(yù)組（B組）、糖尿病對(duì)照組（C組），再次構(gòu)建大鼠背部超長(zhǎng)任意瓣模型(3cm×10 cm)，結(jié)扎皮瓣中包括皮瓣基底部的所有知名血管，徹底止血后，在皮瓣基底床墊入同樣大小無(wú)菌硅膠片，用無(wú)菌縫合線原位縫合，術(shù)后給予常規(guī)的抗炎、抗休克治療，立刻給予腹腔注射適量的生理鹽水及切口表面涂少量的紅霉素軟膏，成模后B組術(shù)后腹腔注射重組人促紅細(xì)胞生

3、成素(rhEPO)(5000 U/kg)，A組、C組腹腔注射等量生理鹽水。
　　 3、對(duì)皮瓣的情況觀察:每日觀察記錄皮瓣的狀況，包括皮瓣的色澤，組織質(zhì)地、彈性。
　　 4、皮瓣成活率的統(tǒng)計(jì):術(shù)后第10天，使用Nikon P310數(shù)碼相機(jī)拍照帶有刻度標(biāo)記的照片，輸入計(jì)算機(jī)，用Image-Pro Plus v6.0軟件統(tǒng)計(jì)計(jì)算三組皮瓣的成活率(皮瓣成活率=皮瓣成活表面積/皮瓣總表面積×100％)。
　　 5、皮瓣的H

4、E染色組織學(xué)觀察:在三組SD大鼠皮瓣的壞死與存活的交界區(qū)域切取組織標(biāo)本，浸泡于4％多聚甲醛溶液中，然后用石蠟包埋，制作成厚約3-4微米的切片，用于HE染色組織學(xué)觀察和免疫組化檢測(cè)。在低高倍鏡下觀察HE染色后切片，觀察組織的水腫、炎癥細(xì)胞的侵潤(rùn)、壞死情況等。
　　 6、相關(guān)指標(biāo)的免疫組化檢測(cè):采用二步法進(jìn)行免疫組化檢測(cè)VEGF、CD31表達(dá)，按VEGF、CD31免疫組化試劑盒的使用說(shuō)明操作。每張片子選擇染色均勻的的區(qū)域，在400倍

5、的光鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍攝保存，拍攝條件設(shè)置參數(shù)均一致。將保存的圖片導(dǎo)入Image-Pro Plus v6.0軟件，檢測(cè)VEGF陽(yáng)性表達(dá)的累積吸光度值，作為評(píng)價(jià)VEGF表達(dá)的指標(biāo)。低倍鏡下(100×)檢視每張切片表達(dá)棕褐色陽(yáng)性顆粒CD31微血管染色分布，確定最高微血管染色區(qū)域，選擇5個(gè)最高微血管染色區(qū)域于高倍鏡下(400×)分別進(jìn)行微血管記數(shù)，計(jì)算平均數(shù)。
　　 7、ELISA檢測(cè)每組大鼠血清中SDF-1α及MMP-9含

6、量:每只大鼠處死后立刻采取摘眼球法，收集5ml的血液，采好的血4℃保存30min，然后低溫(4℃)離心(3000r/min;15min)，約可獲得1-1.5ml的血清標(biāo)本，分別按照MMP-9、SDF-1α ELISA試劑盒說(shuō)明，采用雙抗體夾心法測(cè)定血清中的MMP-9、SDF-1α的含量，分別以ng/ml、pg/ml蛋白為其單位。
　　 結(jié)果：
　　 1、皮瓣情況觀察:術(shù)后第1天，三組皮瓣遠(yuǎn)端均可見(jiàn)不同程度的腫脹、遠(yuǎn)端灰紫

7、色，術(shù)后第5天，三組皮瓣尾端出現(xiàn)點(diǎn)狀的結(jié)痂，壞死跡象開(kāi)始出現(xiàn)，術(shù)后第10天，三組皮瓣的尾端出現(xiàn)明顯的黑色痂殼，壞死區(qū)與存活區(qū)已可分辨出明顯的界限。
　　 2、皮瓣存活率:皮瓣面積C組(33.34±2.01)％明顯低于A(50.17±2.29)％組與B(48.3±2.43)％組(P＜0.01)，A、B組間無(wú)差異。
　　 3、皮瓣的組織學(xué)觀察:糖尿病對(duì)照皮瓣組（C組）較健康對(duì)照組（A組）皮下組織、肉膜組織、肌層組織明顯變薄，

8、血管密度低。糖尿病EP0干預(yù)組（B組）皮瓣組織水腫、血管擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，新生血管數(shù)量和肉芽組織增生程度上明顯優(yōu)于糖尿病對(duì)照組（C組）。
　　 4、免疫組化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè):通過(guò)計(jì)算累積吸光度IOD值，VEGF表達(dá)量A組(4528.16±551.26)、B組(3671.67±482.04)明顯高于C組(2571.08±535.45)(P＜0.01)，A組與B組無(wú)差異。新生微血管計(jì)數(shù)B組(17.5±3.29)個(gè)/mm2明顯高于A

9、組(22.08±3.84)個(gè)/mm2，A、B組均明顯高于C組(11.33±2.42)個(gè)/mm2(P＜0.01)。
　　 5、ELISA相關(guān)指標(biāo)檢測(cè):采用雙抗體夾心法測(cè)定血清中的MMP-9、SDF-1α的含量，結(jié)果顯示血清中SDF-1α、MMP-9的含量A組、B組均明顯高于C組。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，促紅細(xì)胞生成素可能通過(guò)增加SDF-1α、MMP-9、VEGF表達(dá)等途徑促進(jìn)皮瓣生血管增生，減輕炎癥反應(yīng)，從而提高