銀杏提取液對(duì)隨意型皮瓣成活影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 研究銀杏提取液促進(jìn)隨意型皮瓣成活可能的機(jī)制，并對(duì)銀杏提取液的藥理機(jī)理及運(yùn)用進(jìn)行初步探討。
　　 方法：
　　 1．皮瓣模型的構(gòu)建：
　　 將健康SD大鼠隨機(jī)分為銀杏提取液組（實(shí)驗(yàn)組）和生理鹽水組（對(duì)照組），根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用改良的“Mc Farlaneflap”模型，麻醉后以大鼠尾部?jī)慎尼者B線為蒂，在背部正中設(shè)計(jì)一寬3cm、長(zhǎng)9cm超長(zhǎng)矩形隨意型皮瓣。在皮瓣肉膜深層鈍性分離組織，結(jié)扎皮瓣基底

2、部的知名血管。皮瓣制作完成后用醫(yī)用慕絲縫線間斷縫合，術(shù)后抗炎抗休克治療，兩組在手術(shù)后2小時(shí)腹腔注射藥物或生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組每只大鼠每日腹腔注射銀杏注射液100mg/kg，對(duì)照組每只大鼠每日腹腔注射等量生理鹽水。
　　 2．皮瓣大體觀察：
　　 每日對(duì)皮瓣成活進(jìn)行肉眼大體觀察，具體包括皮瓣顏色、組織彈性、質(zhì)地。
　　 3．皮瓣成活面積計(jì)算：
　　 術(shù)后第7天，兩組大鼠在麻醉狀態(tài)下用透明紙準(zhǔn)確描記皮瓣成活及壞死

3、面積，用SONY數(shù)碼相機(jī)拍攝帶有尺度標(biāo)記的照片，然后導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，以Image-ProPlusv6.0軟件測(cè)量皮瓣成活面積和總面積，利用公式(皮瓣成活面積比=皮瓣成活表面積/皮瓣總表面積×100％)，計(jì)算兩組皮瓣成活面積比。
　　 4．微血管造影：
　　 取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各2只共4只大鼠進(jìn)行微血管造影術(shù)。參照樓新法等人的操作方法，先通過往一側(cè)頸動(dòng)脈灌注0.9％生理鹽水，同側(cè)頸靜脈放血的方法排盡大鼠體內(nèi)血液，然后將預(yù)置的明膠

4、+氧化鉛灌注液按照100ml/kg的量緩慢注射入頸動(dòng)脈，當(dāng)觀察到大鼠鞏膜及四肢末端色澤變成造影劑顏色后停止注射。灌注成功后將大鼠冷藏12-24h，使明膠凝固。最后將大鼠背部皮瓣及周圍皮膚解凍后完整解剖，平鋪行X線攝影，觀察皮瓣血管化程度。
　　 5．HE染色及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：
　　 將兩組其他20只大鼠的皮瓣分為三等分，為近蒂部成活區(qū)（Ⅰ區(qū)）、皮瓣壞死與成活并存區(qū)（Ⅱ區(qū)）、皮瓣遠(yuǎn)端壞死區(qū)（Ⅲ區(qū)）[1]，切?、?、Ⅱ、Ⅲ區(qū)組織

5、標(biāo)本，浸泡于10％中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋，制成4微米厚的切片，用于HE染色及免疫組化檢測(cè)。HE染色后在低倍鏡下觀各區(qū)域組織水腫、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。高倍鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)微血管密度情況。
　　 6．免疫組化及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：
　　 通過免疫組化的方法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá)及分布情況。采用二步法對(duì)兩組Ⅱ區(qū)組織切片進(jìn)行染色，每張片子選擇染色均勻的區(qū)

6、域，于40×10倍光鏡下觀察，每張片子取五個(gè)視野拍攝保存，在拍攝過程中，設(shè)置白平衡、快門時(shí)間等參數(shù)一致。將保存的圖片導(dǎo)入Image-ProPlusv6.0軟件，通過對(duì)圖片陽(yáng)性表達(dá)的累積光密度值(IOD)進(jìn)行測(cè)量，作為評(píng)價(jià)生長(zhǎng)因子表達(dá)的指標(biāo)。
　　 結(jié)果：
　　 1．皮瓣大體觀察：
　　 術(shù)后第1天兩組皮瓣出現(xiàn)不同程度的皮膚腫脹、遠(yuǎn)端暗紫色，但無明顯壞死。術(shù)后第3天，皮瓣中、遠(yuǎn)端開始出現(xiàn)局部灶狀、小片狀壞死，壞死部

7、分顏色多為紅褐色，有淤血。至術(shù)后第7天兩組皮瓣中、遠(yuǎn)端壞死部分趨于融合，有黑色痂殼出現(xiàn)，手感變硬，皮瓣分界基本穩(wěn)定。
　　 2．皮瓣成活面積計(jì)算：
　　 經(jīng)軟件測(cè)量，7天后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的皮瓣面積均有不同程度地萎縮，實(shí)驗(yàn)組皮瓣面積平均為(25.67±1.12)cm2，對(duì)照組的皮瓣面積平均為(25.85±1.02)cm2，兩者比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)組成活面積(17.35±1.25)cm2，對(duì)照組成活面積(12.47±0

8、.71)cm2，兩者比較P＜0.01，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，最后得出實(shí)驗(yàn)組皮瓣成活面積比(67.07±3.48)％，對(duì)照組成活面積比為(48.64±2.09)％，兩者比較P＜0.01，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3．微血管造影：
　　 在X線下可觀察到大鼠背部皮膚血管灌注良好，小血管顯影清晰。兩組皮瓣血管化范圍與皮瓣成活范圍較為一致，皮瓣遠(yuǎn)端無血管存在，皮瓣近、中端血管顯影程度較周圍皮膚有所增高，實(shí)驗(yàn)組的血管顯影范圍較對(duì)照組范

9、圍大。
　　 4．HE鏡下觀察及指標(biāo)檢測(cè)：
　　 低倍鏡下觀察到皮瓣Ⅰ區(qū)可見正常皮膚結(jié)構(gòu)，表皮層與真皮層界線清晰，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；皮瓣Ⅲ區(qū)出現(xiàn)均質(zhì)樣改變，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，皮膚附屬器如毛囊結(jié)構(gòu)破壞，組織水腫明顯；低倍鏡下對(duì)照組Ⅱ區(qū)表皮變性萎縮明顯，皮下組織水腫，炎性細(xì)胞侵潤(rùn)嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ區(qū)表皮變性不明顯，皮下組織可見水腫，炎性細(xì)胞侵潤(rùn)較輕。高倍鏡下微血管密度可見實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Ⅰ區(qū)為(31.25±2.92)個(gè)/mm2和

10、(30.75±4.33)個(gè)/mm2；11區(qū)為(22.0±2.16)個(gè)/mm2和(18.38±3.62)個(gè)/mm2，兩組皮瓣Ⅱ區(qū)的微血管密度比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5．免疫組化指標(biāo)檢測(cè)：
　　 免疫組化結(jié)果通過軟件計(jì)算累計(jì)光密度值(IOD)，得到實(shí)驗(yàn)組VEGF陽(yáng)性量為9686.57±430.06，對(duì)照組為4363.05±391.67。實(shí)驗(yàn)組bFGF陽(yáng)性量為5352.83±462.12，對(duì)照組為3016.