天然、重組水蛭素對(duì)大鼠隨意皮瓣淤血模型的影響研究.pdf

1、第一部分天然、重組水蛭素對(duì)大鼠隨意皮瓣淤血模型VEGF、CD34的影響
　　目的:探討天然、重組水蛭素對(duì)大鼠隨意皮瓣淤血模型成活保護(hù)機(jī)制作用，以及對(duì)皮瓣血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、CD34的作用是否相同。
　　方法:1、動(dòng)物模型建立:Wistar大鼠30只，雌雄不限。大鼠麻醉后，取俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，以8％硫化鈉涂于大鼠背部術(shù)區(qū)進(jìn)行脫毛，溫水清洗脫毛區(qū)后用畫線筆設(shè)計(jì)以后正中線為軸，蒂在尾端（以骼棘連線為底）的10cm×

2、3cm的背部超長(zhǎng)隨意皮瓣。消毒術(shù)區(qū)，鋪無菌手術(shù)巾，嚴(yán)格無菌操作。沿設(shè)計(jì)線切開至背部肌膜，在其淺面將皮膚與肉膜由頭端向尾端剝離，保證所形成皮瓣為隨意皮瓣，在皮瓣形成后即刻3-0絲線縫合。根據(jù)術(shù)后注射藥物不同，皮瓣隨機(jī)分為3組(n=30)，每組10只。A組在皮下注射5u天然水蛭素;B組皮下注射5u重組水蛭素;C組皮下注射相同劑量生理鹽水。每組皮瓣注射部位均為在距皮瓣末端約1.5cm和3cm處，分術(shù)后即刻、第3、5天注射達(dá)皮下層次。
　

3、　2、術(shù)后對(duì)大鼠背部皮瓣進(jìn)行連續(xù)的臨床觀察并記錄。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否出現(xiàn)腹瀉，弓背，翹毛，精神萎靡及皮膚潰瘍等免疫排斥反應(yīng)。觀察皮瓣顏色、厚度、彈性、滲出、毛發(fā)生長(zhǎng)、壞死范圍及針刺皮瓣出血情況，詳細(xì)記錄。
　　3、術(shù)后第7天，在皮瓣遠(yuǎn)端約2～3 cm處切取0.5cm×0.5cm大小全層皮膚組織;組織浸泡于4％多聚甲醛液中。固定7天后石蠟包埋，制成4um厚的切片，HE染色。觀察皮瓣組織的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞水腫、毛細(xì)血管增生、肉芽組織

4、生成等情況。
　　4、手術(shù)后的第3、5、7天分別在皮瓣遠(yuǎn)端2～3 cm處取約0.5cm×0.5cm大小的全層組織，測(cè)定VEGF、CD34含量，以血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和CD34作為血管標(biāo)記行免疫組化染色，計(jì)數(shù)皮瓣新生血管密度。熒光RT-PCR測(cè)定VEGFmRNA表達(dá)量。
　　5、術(shù)后第7天，麻醉大鼠后，展平背部，用數(shù)碼照相機(jī)拍攝皮瓣情況，用Image-Pro6.0軟件分析系統(tǒng)計(jì)算皮瓣壞死面積、成活面積和總面積并計(jì)算皮瓣成活率。

5、
　　結(jié)果:1、皮瓣存活情況的大體觀察三組大鼠均無死亡，皮瓣術(shù)后無感染。術(shù)后第7天，三組皮瓣遠(yuǎn)端不同面積痂殼形成，壞死區(qū)域穩(wěn)定，成活與壞死界限較清楚，天然、重組水蛭素組皮瓣痂殼呈現(xiàn)深淺不一致灰色，淺灰色，部分痂殼較軟，能輕易剝落，剝落后可見創(chuàng)面鮮紅出血，對(duì)照組痂殼呈棕深黑，較硬，不易剝落，局部有潰爛。
　　2、皮瓣組織學(xué)觀察術(shù)后7天，天然水蛭素組皮瓣表皮完整，無萎縮，輕度角化過度，真皮內(nèi)及皮下無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織無水腫，

6、真皮下微血管多;重組水蛭素組表皮萎縮不明顯，皮下組織輕度水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)略重，真皮下微血管較多;對(duì)照組皮下水腫明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部表皮潰瘍形成，真皮下僅有少量微血管。
　　3、VEGF染色陽性的各實(shí)驗(yàn)組血管密度值免疫組化著色好，染色效果好，背景干凈無污染，陽性細(xì)胞顯示明確。VEGF主要定位于細(xì)胞漿中，VEGF陽性表達(dá)的細(xì)胞被染成棕色顆粒。術(shù)后第3天，VEGF染色陽性血管數(shù)目:天然水蛭素組(A)為41.71±3.08，重組

7、水蛭素組(B)為33.05±2.23，對(duì)照組(C)為14.71±2.67，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組VEGF染色陽性血管數(shù)最多，B組次之，C組最少。術(shù)后第5天，VEGF染色陽性血管數(shù)目:天然水蛭素組(A)為55.24±3.96，重組水蛭素組(B)為41.63±3.97，對(duì)照組(C)為8.63±2.59，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組VEGF染色陽性血管數(shù)最多，B組次之，C組最少。術(shù)后第7天，VEGF染色陽性血管數(shù)目:天然水蛭

8、素組(A)為40.76±3.69，重組水蛭素組(B)為32.93±2.54，對(duì)照組(C)為3.58±2.97，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組VEGF染色陽性血管數(shù)最多，B組次之，C組最少。在A組，VEGF染色陽性血管數(shù)目在術(shù)后第5天與第3、7天相比P＜0.05，高峰在術(shù)后第5天:在B組，VEGF染色陽性血管數(shù)目在術(shù)后第5天與第3、7天相比P＜0.05，高峰在術(shù)后第5天;在C組，VEGF染色陽性血管數(shù)目在術(shù)后第3天與第5、7天兩兩相比

9、P＜0.05，高峰在術(shù)后第3天。
　　4、CD34染色陽性的各實(shí)驗(yàn)組血管密度值 CD34主要定位于細(xì)胞漿中，少量在細(xì)胞膜亦有表達(dá)，CD34陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色至棕褐色顆粒。術(shù)后第3天，CD34染色陽性血管數(shù)目:天然水蛭素組(A)為56.83±3.19，重組水蛭素組(B)為47.12±2.13，對(duì)照組(C)為21.82±2.56，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組CDM染色陽性血管數(shù)最多，B組次之，C組最少。術(shù)后第5天，CD34染色

10、陽性血管數(shù)目:天然水蛭素組(A)為70.13±3.85，重組水蛭素組(B)為52.74±3.08，對(duì)照組(C)為16.52±2.48，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組CD34染色陽性血管數(shù)最多，B組次之，C組最少。術(shù)后第7天，CD34染色陽性血管數(shù)目:天然水蛭素組(A)為55.87±3.75，重組水蛭素組(B)為45.93±3.65，對(duì)照組(C)為11.47±2.87，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組CD34染色陽性血管數(shù)最多，B組

11、次之，C組最少。在A組，CD34染色陽性血管數(shù)目在術(shù)后第5天與第3、7天相比P＜0.05，高峰在術(shù)后第5天;在B組，CD34染色陽性血管數(shù)目在術(shù)后第5天與第3、7天相比P＜0.05，高峰在術(shù)后第5天;在C組，CD34染色陽性血管數(shù)目在術(shù)后第3天與第5、7天兩兩相比P＜0.05，高峰在術(shù)后第3天。
　　5、熒光RT-PCR檢測(cè)各組皮瓣組織VEGFmRNA的表達(dá)電泳后各泳道均可見特異性條帶，與DNA標(biāo)記進(jìn)行比較，產(chǎn)物大小與預(yù)期產(chǎn)物大小

12、一致，分別為VEGF164 bp，GAPDH152 bp。術(shù)后第3天，VEGFmRNA的表達(dá):天然水蛭素組(A)為28.69±2.07，重組水蛭素組(B)為23.94±3.12，對(duì)照組(C)為19.64±1.92，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組VEGFmRNA的表達(dá)最多，B組次之，C組最少。術(shù)后第5天，VEGFmRNA的表達(dá):天然水蛭素組(A)為33.13±4.07，重組水蛭素組(B)為29.52±2.89，對(duì)照組(C)為15.52

13、±3.48，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組VEGFmRNA的表達(dá)最多，B組次之，C組最少。術(shù)后第7天，VEGFmRNA的表達(dá):天然水蛭素組(A)為27.87±2.58，重組水蛭素組(B)為22.93±3.43，對(duì)照組(C)為10.47±2.86，各組兩兩比較P＜0.05，其中A組VEGFmRNA的表達(dá)最多，B組次之，C組最少。在A組，VEGFmRNA的表達(dá)在術(shù)后第5天與第3、7天相比P＜0.05，高峰在術(shù)后第5天;在B組，VEGFm

14、RNA的表達(dá)在術(shù)后第5天與第3、7天相比P＜0.05，高峰在術(shù)后第5天;在C組，VEGFmRNA的表達(dá)在術(shù)后第3天與第5、7天兩兩相比P＜0.05，高峰在術(shù)后第3天。
　　6、皮瓣存活表面積:皮瓣存活表面積:天然水蛭素組(A):26.64±2.24(cm2)，重組水蛭素組(B):23.64±2.02(cm2)，對(duì)照組(C):20.71±1.41(cm2);皮瓣存活率(％):天然水蛭素組(A):88.87±2.24，重組水蛭素組(B

15、):79.97±2.02，對(duì)照組(C):69.07±1.42.各組之間兩兩比較，P＜0.05。
　　結(jié)論:天然、重組水蛭素能夠促進(jìn)隨意皮瓣VEGF、CD34表達(dá)，改善淤血皮瓣的微循環(huán)，有利于新生血管的生成，能夠提高隨意皮瓣的成活率，天然水蛭素效果優(yōu)于重組水蛭素。
　　第二部分天然、重組水蛭素對(duì)大鼠隨意皮瓣淤血模型SOD、MDA、ET影響
　　目的:探討天然、重組水蛭素對(duì)大鼠隨意皮瓣淤血模型存活保護(hù)機(jī)制作用，以及對(duì)皮瓣的

16、丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶(SOD)、內(nèi)皮素(ET)作用是否相同。
　　方法:1、動(dòng)物模型建立:同第一部分。
　　2、術(shù)后對(duì)大鼠背部皮瓣進(jìn)行連續(xù)的臨床觀察并記錄。同第一部分。
　　3、皮瓣組織學(xué)的觀察，同第一部分。
　　4、術(shù)后第7天測(cè)定皮瓣成活率，以及丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶(SOD)、內(nèi)皮素(ET)含量;其中丙二醛（MDA）的檢測(cè)采用硫代巴比妥酸法，超氧化物岐化酶(SOD)的檢測(cè)采用羥胺法，內(nèi)皮

17、素(ET)的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法。
　　結(jié)果:1、皮瓣存活情況的大體觀察同第一部分。
　　2、皮瓣組織學(xué)觀察同第一部分
　　3、術(shù)后第7天皮瓣組織丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶(SOD)、內(nèi)皮素(ET)含量:皮瓣組織丙二醛（MDA）含量:天然水蛭素組(A):10.20±3.41(nmol/mgprot)，重組水蛭素組(B):22.12±3.84(nmol/mgprot)，對(duì)照組(C):32.65±3.91(nm

18、ol/mgprot);各組之間兩兩比較，P＜0.05。術(shù)后第7天皮瓣組織超氧化物岐化酶(SOD)含量:天然水蛭素組(A):72.59±17.48(U/mgprot)，重組水蛭素組(B):36.68±8.32(U/mgprot)，對(duì)照組(C):27.66±11.34(U/mgprot);各組之間兩兩比較，P＜0.05。術(shù)后第7天皮瓣組織內(nèi)皮素(ET)含量:天然水蛭素組(A):85.67±37.90，重組水蛭素組(B):163.55±43.

19、45，對(duì)照組(C):247.56±38.04;各組之間兩兩比較，P＜0.05。用藥組（A組和B組）皮瓣成活率比對(duì)照組（C組）高，超氧化物岐化酶(SOD)用藥組（A組和B組）比對(duì)照組（C組）明顯增多，丙二醛（MDA）、內(nèi)皮素(ET)含量則減少。
　　4、皮瓣存活表面積:同第一部分。
　　結(jié)論:水蛭素能夠提高隨意皮瓣的成活率、超氧化物岐化酶(SOD)的含量;減低皮瓣的壞死率、丙二醛(MDA)、內(nèi)皮素(ET)的含量。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組