Mfn-2對rVSMCs細胞周期的調控作用.pdf

1、本文主要從以下三個方面展開論述：
　　第一部分 Mfn-1和Mfn-2在rVSMCs細胞周期中的表達差異
　　研究目的：研究線粒體融合素基因-2與線粒體融合素基因-1在大鼠血管平滑肌細胞周期中的表達差異,旨在闡明對大鼠血管平滑肌細胞周期具有調控作用的線粒體融合素基因。
　　方法：采用無血清培養(yǎng)基同步化24小時，無血清培養(yǎng)基同步化48小時后換用含10％血清的培養(yǎng)基再生長18小時，胸腺嘧啶核苷和諾考達唑先后作用12小時誘導

2、大鼠血管平滑肌細胞進入細胞周期不同階段，分為兩組，其中一組PI染色后進行流式細胞術檢測，另一組提取細胞總蛋白后進行Western Blot分析線粒體融合素基因-2、線粒體融合素基因-1和細胞周期依賴性激酶抑制劑p27、p21、pRb的表達。
　　結果：流式細胞術結果顯示，無血清培養(yǎng)基同步化24小時后，平均80.10％的大鼠血管平滑肌細胞進入G0/G1期；無血清培養(yǎng)基同步化48小時后換用含10％血清的培養(yǎng)基再生長18小時后，平均61

3、.27％的大鼠血管平滑肌細胞進入S期；胸腺嘧啶核苷和諾考達唑先后作用12小時后，平均75.06％的大鼠血管平滑肌細胞進入G2/M期;處于正常生長周期中的大鼠血管平滑肌細胞G0/G1期、S期和G2/M期的細胞分布平均為51.36％,39.52％,9.12％，作為對照。Western Blot分析表明，G0/G1期線粒體融合素基因-2和細胞周期依賴性激酶抑制劑p27、p21的表達與對照組和G2/M期相比明顯升高（P＜0.05），pRb的表達

4、降低；而線粒體融合素基因-1G0/G1期的表達與對照組相比，無明顯差異。
　　結論：在大鼠血管平滑肌細胞G0/G1期線粒體融合素基因-2的表達明顯增高，而線粒體融合素基因-1的表達并無明顯變化，表明線粒體融合素基因-2對大鼠血管平滑肌的細胞周期具有調控作用。
　　第二部分 rVSMCs細胞周期不同階段形態(tài)與代謝的變化
　　研究目的：研究大鼠血管平滑肌細胞周期不同階段細胞器的形態(tài)改變和代謝變化。
　　方法：將大鼠血

5、管平滑肌細胞阻滯于細胞周期的不同階段，采用激光共聚焦顯微鏡觀察經MitoTracker Red染色的線粒體形態(tài)的變化；通過透射電子顯微鏡顯示線粒體超微結構的改變、線粒體與內質網毗鄰關系的變化以及自噬溶酶體的形成和積累過程；JC-1處理后運用流式細胞術檢測線粒體膜電位的變化；采用化學法葡萄糖檢測試劑盒、氨基酸檢測試劑盒、ATP比色測定試劑盒、NAD＋/NADH定量檢測試劑盒和NADP＋/NADPH定量檢測試劑盒檢測葡萄糖代謝、氨基酸代謝、

6、ATP代謝、NAD＋/NADH和NADP＋/NADPH的變化。
　　結果：激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，G0/G1期線粒體呈管網狀分布，而對照組以及S期線粒體呈散在的粒狀分布，G2/M期線粒體呈散在的團狀分布；進一步通過透射電子顯微鏡顯示G0/G1期線粒體與內質網的毗鄰關系更近，而且內質網甚至被拉向線粒體；S期線粒體與內質網分離，而且線粒體腫脹、嵴斷裂，內質網池擴張；G2/M期線粒體數(shù)量減少，出現(xiàn)大量的自噬溶酶體。流式細胞術檢測表

7、明，從G0/G1期至G2/M期線粒體膜電位明顯下降（P＜0.05）。采用化學法檢測發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝、氨基酸代謝、ATP代謝和NADP＋/NADPH在整個細胞周期中并未明顯變化，NAD＋含量在G0/G1期明顯降低（P＜0.05）。
　　結論：盡管在大鼠血管平滑肌細胞的整個細胞周期中，葡萄糖、氨基酸和ATP代謝無顯著改變，但是在大鼠血管平滑肌細胞G0/G1期，當線粒體融合素基因-2表達升高時，線粒體密集呈管網狀分布，且內質網被拉向線粒

8、體，NAD＋含量明顯降低；而在大鼠血管平滑肌細胞G2/M期，當線粒體融合素基因-2含量降低時，線粒體膜電位急劇下降，伴隨大量的自噬溶酶體形成。
　　第三部分 Mfn-2對rVSMCs線粒體重塑的影響
　　目的：研究過表達線粒體融合素基因-2對大鼠血管平滑肌細胞線粒體形態(tài)變化的影響。
　　方法：構建Mfn-2的腺病毒載體Adv-Mfn-2-S442A，采用Adv-Mfn-2-S442A的不同感染復數(shù)25pfu/細胞和50

9、pfu/細胞感染血管平滑肌細胞24小時后，激光共聚集顯微鏡觀察MitoTracker Red染色后線粒體形態(tài)的變化。
　　結果：成功構建Mfn-2的腺病毒載體Adv-Mfn-2-S442A；Adv-Mfn-2-S442A以感染復數(shù)25pfu/細胞感染血管平滑肌細胞24小時后，激光共聚集顯微鏡顯示MitoTracker Red染色的線粒體在細胞漿內呈散在團狀分布；Adv-Mfn-2-S442A以不同感染復數(shù)50pfu/細胞感染血管平