鉛對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控突觸形成和神經(jīng)元內(nèi)信息傳遞的影響.pdf

1、鉛是一種常見的職業(yè)與環(huán)境污染物，具有顯著神經(jīng)毒性作用，可造成學(xué)習(xí)記憶的損傷。迄今，鉛損害學(xué)習(xí)記憶方面的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但具體機(jī)制仍不十分清楚，還有待進(jìn)一步的研究。
　　腦的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)是由相互作用的神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)共同參與調(diào)控的。星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，AS)是腦組織內(nèi)數(shù)量最多和分布最廣的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育和遷移、突觸的形成、遞質(zhì)傳遞的調(diào)節(jié)以及內(nèi)、外環(huán)境的穩(wěn)定等都起著十分重要的作用。腦組織超微結(jié)構(gòu)

2、顯示，AS與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和周細(xì)胞等共同構(gòu)成血-腦屏障，血液中的外來(lái)化學(xué)物質(zhì)必須通過(guò)AS才能進(jìn)入神經(jīng)元。另外，研究發(fā)現(xiàn)AS是鉛的“儲(chǔ)藏池”。因此，我們有理由推測(cè)AS可能是鉛在腦組織中初始損傷的靶細(xì)胞。
　　研究顯示，AS能夠通過(guò)分泌膠質(zhì)源性神經(jīng)調(diào)質(zhì)影響突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸后膜的受體反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)突觸可塑性。如果AS是鉛損傷的初始靶細(xì)胞，那么其功能異常能否引起突觸形成及神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常呢？
　　綜上所述，本

3、實(shí)驗(yàn)以神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)為研究主線，以原代培養(yǎng)的AS和神經(jīng)元為試驗(yàn)對(duì)象，探討AS內(nèi)鉛能否對(duì)突觸形成與神經(jīng)元內(nèi)信息傳遞產(chǎn)生影響，為揭示鉛損害學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制提供新的研究方向和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1、AS原代培養(yǎng)及ACM的制備
　　取出生1～3天Wistar大鼠仔鼠，消毒后，斷頭取大腦皮質(zhì)，剪碎、胰酶消化結(jié)合機(jī)械吹打使細(xì)胞分散，將細(xì)胞懸液接種在玻璃培養(yǎng)皿中，差速粘附處理去除成纖維細(xì)胞，將未粘附的細(xì)胞懸液接種在培

4、養(yǎng)瓶中。GFAP染色鑒定細(xì)胞純度。
　　純化AS形成單層，換成含鉛濃度為0、50、100和200μmol/L的培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h。鉛暴露后，棄培養(yǎng)液，換成含0和25μmol/L谷氨酸的細(xì)胞外液，作用10 min，棄去培養(yǎng)基，換成無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心過(guò)濾，制成AS條件培養(yǎng)液，保存?zhèn)溆谩?br>　　2、神經(jīng)元的培養(yǎng)與純化
　　取新生Wistar大鼠仔鼠，分離大腦皮質(zhì)，剪碎后胰酶消化，過(guò)濾，離心，加入

5、含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)24 h。換Neurobasalmedium并加入阿糖胞苷，培養(yǎng)3d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)3d，特異性烯醇化酶染色鑒定細(xì)胞純度。
　　3、神經(jīng)元分組與處理
　　將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機(jī)分為純培養(yǎng)組（原代培養(yǎng)神經(jīng)元不加入ACM）、非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組、Glu誘導(dǎo)（無(wú)鉛暴露）ACM處理組和50、100和200μmol/L鉛暴露的ACM處理組。加入ACM時(shí)棄去神經(jīng)元純培養(yǎng)體系

6、中5/7的培養(yǎng)液，新加培養(yǎng)液由ACM和Neurobasal medium按3∶2構(gòu)成。
　　4、檢測(cè)指標(biāo)與方法
　　(1) GFAP和NSE免疫熒光染色鑒定AS和神經(jīng)元
　　(2)倒置顯微鏡觀察鉛暴露AS細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)并采集圖像
　　(3) AlamarBlue法檢測(cè)細(xì)胞活力
　　(4)倒置顯微鏡觀察不同ACM處理的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)并采集圖像
　　(5) Western Blotting法檢測(cè)神經(jīng)元

7、SYP蛋白表達(dá)
　　(6)突觸素免疫熒光雙標(biāo)細(xì)胞化學(xué)染色觀察紅色熒光顆粒數(shù)
　　(7) Western Blot法檢測(cè)NR1、NR2A、NR2B、CaMKⅡ和AC蛋白的表達(dá)
　　5、統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)(SNK)。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1、AS與神經(jīng)元免疫熒光

8、鑒定
　　GFAP免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞為AS，其胞漿呈紅色;NSE免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞為神經(jīng)元，胞漿被染成綠色，經(jīng)計(jì)數(shù)神經(jīng)元純度大于95％，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。
　　2、鉛暴露后AS形態(tài)觀察
　　50和100μmol/L鉛暴露組AS形態(tài)與對(duì)照組相比未見明顯改變，而200μmol/L鉛暴露組的少量細(xì)胞開始脫壁，細(xì)胞間隙增大;隨鉛暴露濃度的增加，脫壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，400μmol/L鉛暴露組細(xì)胞變大，突起變短或消失。

9、800μmol/L鉛暴露組細(xì)胞大量脫壁，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　3、不同劑量鉛暴露對(duì)AS活力的影響
　　各鉛暴露組細(xì)胞活力隨染鉛濃度的升高而下降，200μmol/L鉛暴露組細(xì)胞活力為對(duì)照組的77％，800μmol/L鉛暴露組細(xì)胞活力僅為對(duì)照組的一半。
　　4、不同ACM處理后神經(jīng)元形態(tài)觀察
　　培養(yǎng)5d后的神經(jīng)元細(xì)胞5-10個(gè)聚集成團(tuán)，周圍突起清晰，均勻細(xì)長(zhǎng)，突起之間相互交織成網(wǎng)。與純培養(yǎng)組比較，無(wú)鉛暴露ACM處

10、理組的神經(jīng)元集落間突起豐富，網(wǎng)絡(luò)稠密;與無(wú)鉛暴露ACM處理組比較，200μmol/L鉛暴露ACM處理組的神經(jīng)元突起連接相對(duì)稀疏，連接收到損傷。
　　5、鉛暴露AS的對(duì)神經(jīng)元內(nèi)SYP蛋白表達(dá)的影響
　　與純培養(yǎng)組相比，各時(shí)段的非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組和Glu誘導(dǎo)的ACM處理組的神經(jīng)元內(nèi)SYP蛋白含量顯著增加;與無(wú)鉛暴露ACM處理組相比，培養(yǎng)72h的各鉛暴露的ACM處理組的神經(jīng)元內(nèi)SYP蛋白含量隨染鉛劑量的升高而顯著降低，培養(yǎng)

11、48 h的200μmol/L鉛暴露ACM處理組的神經(jīng)元內(nèi)SYP蛋白含量顯著降低，培養(yǎng)24 h的各鉛暴露的ACM處理組的神經(jīng)元內(nèi)SYP蛋白含量未見顯著改變。
　　6、突觸素?zé)晒馊旧^察突觸形成
　　突觸素?zé)晒鈽?biāo)記物呈紅色顆粒狀，沿神經(jīng)元胞體和突起排列，可清晰勾勒出神經(jīng)元胞體和突起的輪廓，有的呈串珠狀，在胞體部分有些可融合成塊狀。非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組和Glu誘導(dǎo)的ACM處理組的SYP熒光顆粒數(shù)顯著高于純培養(yǎng)組。此外，非誘導(dǎo)

12、的ACM處理組的SYP熒光顆粒數(shù)也顯著高于Glu誘導(dǎo)的ACM處理組。各鉛暴露的ACM處理組的SYP熒光顆粒數(shù)量與無(wú)鉛暴露的ACM處理組比較顯著降低，并隨鉛暴露劑量的升高而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7、鉛暴露ACM對(duì)神經(jīng)元NMDA受體亞單位、CaMKⅡ、AC蛋白表達(dá)的影響
　　與純培養(yǎng)組相比，培養(yǎng)8h的非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組的神經(jīng)元內(nèi)NR1蛋白表達(dá)顯著增加，而Glu誘導(dǎo)的ACM處理組的神經(jīng)元內(nèi)NR1蛋白表達(dá)顯著減少;與

13、非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組相比，培養(yǎng)4h和8h的Glu誘導(dǎo)的ACM處理組的神經(jīng)元內(nèi)NR1蛋白表達(dá)顯著減少;與無(wú)鉛暴露的ACM處理組相比，培養(yǎng)4h的200μmol/L鉛暴露的ACM處理組、培養(yǎng)8h的100和200μmol/L鉛暴露的ACM處理組及培養(yǎng)12h的各濃度鉛暴露的ACM處理組的神經(jīng)元內(nèi)NR1蛋白含量顯著減少。與純培養(yǎng)組相比，非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組及培養(yǎng)4h、12 hGlu誘導(dǎo)的ACM處理組NR2A蛋白表達(dá)顯著增加，培養(yǎng)8 hG

14、lu誘導(dǎo)的ACM處理組NR2A蛋白表達(dá)顯著減少;與非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組相比，各時(shí)段誘導(dǎo)無(wú)鉛暴露ACM處理組NR2A蛋白表達(dá)顯著減少;與無(wú)鉛暴露ACM處理組相比，培養(yǎng)4h各劑量鉛暴露ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)NR2A蛋白表達(dá)沒(méi)有差異;培養(yǎng)8h的200μmol/L鉛暴露ACM處理組及12 h各鉛暴露ACM處理培養(yǎng)組神經(jīng)元內(nèi)NR2A蛋白表達(dá)明顯減少。與純培養(yǎng)組相比，各時(shí)段非Glu誘導(dǎo)的ACM組和Glu誘導(dǎo)ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)NR2B蛋白表達(dá)顯

15、著增高;與非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組相比，Glu誘導(dǎo)ACM處理組NR2B蛋白表達(dá)4h顯著增高，8h及12h顯著減少;與無(wú)鉛暴露ACM處理組相比，4h各劑量鉛暴露ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)NR2B蛋白顯著增加;8h、12h鉛暴露ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)NR2B蛋白表達(dá)均為50、100μmol/L組顯著增加，200μmol/L組顯著減少。
　　與純培養(yǎng)組相比，各時(shí)段非Glu誘導(dǎo)的組和Glu誘導(dǎo)的ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)顯著增高;與

16、非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組相比，培養(yǎng)12 hGlu誘導(dǎo)的ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)顯著減少;與無(wú)鉛暴露ACM處理組相比，培養(yǎng)4h的各劑量鉛暴露ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)沒(méi)有差異;培養(yǎng)8h的200μmol/L鉛暴露ACM處理組及12 h各劑量鉛暴露ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)CaMKⅡ蛋白表達(dá)顯著減少。與純培養(yǎng)組相比，各時(shí)段非Glu誘導(dǎo)的ACM處理組和Glu誘導(dǎo)ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)AC蛋白表達(dá)顯著增高;與非Glu誘導(dǎo)的AC

17、M處理組相比，Glu誘導(dǎo)ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)AC蛋白表達(dá)培養(yǎng)4h及12h顯著增加;與無(wú)鉛暴露ACM處理組相比，培養(yǎng)4h的100、200μmol/L鉛暴露ACM處理組及培養(yǎng)8h、12h各劑量鉛暴露ACM處理組神經(jīng)元內(nèi)AC蛋白表達(dá)明顯減少。
　　結(jié)論：
　　1、鉛暴露AS可間接抑制神經(jīng)元間突觸的形成。
　　2、鉛暴露AS對(duì)突觸形成的抑制作用可能與其抑制神經(jīng)元內(nèi)NMDAR的亞單位表達(dá)，進(jìn)而干擾CaMKⅡ和AC依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通