選擇性激活星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元樹突絲運(yùn)動(dòng)的影響.pdf

1、背景和目的:星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的作用越來越受到重視,已知星形膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放多種活性物質(zhì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生、突觸形成以及調(diào)節(jié)突觸傳遞等各種神經(jīng)元功能起重要調(diào)制作用。除了谷氨酸,星形膠質(zhì)細(xì)胞還可以釋放D-絲氨酸對(duì)神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的產(chǎn)生起重要作用以及釋放ATP對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)產(chǎn)生異突觸抑制,提示膠質(zhì)細(xì)胞可以通過釋放信號(hào)分子對(duì)突觸功能具有重要調(diào)節(jié)作用。另一方面,樹突棘形態(tài)和活動(dòng)狀態(tài)與突觸功能密切相關(guān),但有關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)樹突棘的影響,人們了解很少。最

2、近用雙光子成像技術(shù)的研究顯示,星形膠質(zhì)細(xì)胞突起的活動(dòng)與其鄰近樹突絲的運(yùn)動(dòng)密切相關(guān),星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起通過直接接觸,具有穩(wěn)定樹突絲活動(dòng)和促進(jìn)樹突絲的發(fā)育的作用。但星形膠質(zhì)細(xì)胞是否可通過釋放信號(hào)分子來調(diào)節(jié)樹突絲形態(tài)和運(yùn)動(dòng)目前還不清楚。我們的研究目的是建立藍(lán)光刺激膠質(zhì)細(xì)胞(表達(dá)光敏感通道ChR2)對(duì)神經(jīng)元樹突絲形態(tài)及運(yùn)動(dòng)檢測(cè)的模型,實(shí)現(xiàn)選擇性激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,研究星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮對(duì)神經(jīng)元樹突絲運(yùn)動(dòng)的影響及其可能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　

3、實(shí)驗(yàn)方法:原代培養(yǎng)SD大鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞,并建立星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的混合培養(yǎng)模型。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將光敏感通道(Channelrhodopsin2)轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,當(dāng)Channelrhodopsin2在細(xì)胞膜表面表達(dá)后,用470mm藍(lán)色脈沖光(刺激模式為1Hz,800ms open,200msclosed,10次/串)照射星形膠質(zhì)細(xì)胞,并用激光共聚焦顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)(以鈣波為活動(dòng)信號(hào))。采用電

4、轉(zhuǎn)方法將熒光蛋白GFP轉(zhuǎn)入神經(jīng)元細(xì)胞,并用激光共聚焦顯微鏡觀察第4～5天神經(jīng)元細(xì)胞樹突絲的形態(tài)和運(yùn)動(dòng),同時(shí)給予100μMATP或100μM谷氨酸,觀察ATP或谷氨酸對(duì)神經(jīng)元樹突絲的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的影響。對(duì)混合培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予上述模式的光刺激,同樣激光共聚焦顯微鏡觀察混合培養(yǎng)的第4～5天的神經(jīng)元細(xì)胞樹突絲的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。最后用Metamorph軟件對(duì)ATP、谷氨酸或光刺激混合培養(yǎng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元樹突絲形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的影響做定量分析。

5、r>　　 結(jié)果:1.Channelrhodopsin2可以穩(wěn)定表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面,并可維持一周左右的時(shí)間。我們對(duì)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的光刺激模式進(jìn)行摸索,發(fā)現(xiàn)模式為1Hz,800ms open,200ms closed,10次/串時(shí)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有較好的激活作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的鈣波,大致分為四種情況:單次短時(shí)程鈣波,多次短時(shí)程鈣波,單次長(zhǎng)時(shí)程鈣波,多次即時(shí)鈣波。2.在單獨(dú)培養(yǎng)的情況下,100μM的ATP或100μM谷氨

6、酸可以抑制處于體外培養(yǎng)第4～5天的神經(jīng)元樹突絲的運(yùn)動(dòng),給藥前后有顯著性差異。3.在混合培養(yǎng)的模型中,用光刺激器選擇性激活星形膠質(zhì)細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樹突絲的運(yùn)動(dòng)同樣被抑制,定量分析顯示有顯著性差異。
　　 結(jié)論:Channelrhodopsin2可以穩(wěn)定表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面,運(yùn)用光刺激可以選擇性激活混合培養(yǎng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞的興奮可以抑制神經(jīng)元樹突絲的運(yùn)動(dòng),效果與100μMATP或100μM谷氨酸類似。這表明星形膠