孕酮抑制Aβ誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化所致神經(jīng)元損傷.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是人類最常見的年齡相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是癡呆中最普遍的一種形式。其主要病理學(xué)變化包括:β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)、突觸缺失、神經(jīng)元變性死亡以及星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化和增生等。星形膠質(zhì)細(xì)胞在AD的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中具有雙刃劍的作用，適度激

2、活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可胞吞Aβ蛋白，釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，保護(hù)神經(jīng)元，緩解AD的病理進(jìn)展，但過(guò)度激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)釋放神經(jīng)毒性的細(xì)胞因子和其他毒性物質(zhì)，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡。神經(jīng)甾體(neurosteroid)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中甾體類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的總稱，主要由膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元合成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮廣泛作用。研究顯示，在多種神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)甾體水平發(fā)生明顯變化，尤其AD患者腦脊液中PROG及AP水平與正常同齡人相比顯著下降

3、。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)在AD病理模型中，大鼠神經(jīng)元的神經(jīng)甾體合成代謝發(fā)生明顯變化，但是在AD病理模型下，星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體的合成代謝，以及神經(jīng)甾體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元交互作用中的影響尚未研究。因此本研究使用β淀粉樣蛋白構(gòu)建AD樣細(xì)胞模型，檢測(cè)Aβ活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞合成代謝神經(jīng)甾體的變化，進(jìn)而確定與其活化關(guān)系密切的神經(jīng)甾體，并闡述神經(jīng)甾體對(duì)Aβ活化膠質(zhì)細(xì)胞的影響，及其在膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元交互作用中的影響。本研究為神經(jīng)甾體在AD防治中的

4、應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　1.1 大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)取新生Spague-Dawley(SD)大鼠，無(wú)菌條件下取大腦皮質(zhì)，剪碎，37℃水浴中胰酶消化15-20 min，含10％FBS的高糖Dulbecco's ModifiedEagle's Medium(DMEM)終止消化。使用巴氏吸管吹散細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，37℃，5％ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育

5、，每隔2-3 d全量更換培養(yǎng)液至細(xì)胞基本融合。使用‘二次震蕩法’純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP免疫熒光染色結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞純度超過(guò)95％。純化后星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)消化、重懸，以1×105個(gè)/mL密度接種于孔板中，含10％FBS的DMEM培養(yǎng)。
　　1.2 大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)取新生24 h內(nèi)SD大鼠大腦皮質(zhì)，胰蛋白酶消化輔以機(jī)械分離法分離細(xì)胞，懸浮于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的玻片上，在37℃，5％

6、CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，6h后首次換液為含2％B27的neurobasal培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，48 h以后完全換液，此后每?jī)商彀肓繐Q液。取培養(yǎng)6-7 d的神經(jīng)元細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。
　　1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的共培養(yǎng)參照文獻(xiàn)方法略有改進(jìn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于處理過(guò)的六孔板中，每個(gè)孔底部含有4個(gè)約2mm高的石蠟小柱，用于支撐載玻片;神經(jīng)元培養(yǎng)在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載破

7、片上，培養(yǎng)7天后，將載有神經(jīng)元的玻片放入經(jīng)不同藥物處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液為DMEM（不含Aβ、PROG），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組與給藥
　　2.1 Aβ1-42處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)不同濃度的Aβ1-42處理，隨機(jī)分為Control、AβL(1μM)、AβM（5μM）、AβH(10μM)四組，處理24 h，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)炎癥因子的釋放。
　　2.2 Aβ1-4

8、2處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體水平的影響星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)膽固醇和Aβ1-42處理，隨機(jī)分為空白組、Control組(膽固醇底物組，膽固醇濃度為10μM)、Aβ組（膽固醇+Aβ1-42，膽固醇和Aβ1-42濃度分別為10μM和5μM），處理24 h，檢測(cè)神經(jīng)甾體的水平。
　　2.3 PROG處理對(duì)Aβ1-42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響星形膠質(zhì)細(xì)胞分別加入不同濃度PROG（0，0.01μM，0.1μM，1μM）與Aβ1-42（5μM），隨機(jī)分

9、為Control、Aβ、PL、PM、PH五組，共同處理24 h，用于檢測(cè)炎癥因子的釋放、NF-κB的活性及與神經(jīng)元共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
　　3.GFAP標(biāo)記免疫熒光染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)通過(guò)對(duì)GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性中間纖維蛋白）免疫熒光染色，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。各組細(xì)胞加藥處理后，取出細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛固定30 min，兔源GFAP(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。
　　4.ELISA測(cè)

10、定星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1β和TNFα的水平取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，3000 rpm離心，取上清，按試劑盒說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。
　　5.HPLC-MS法測(cè)定星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體水平取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，加入內(nèi)標(biāo)甲睪酮，用乙酸乙酯/正己烷萃取，合并有機(jī)相，50℃水浴下氮?dú)獯蹈桑?0℃水浴中2-硝基-4-三氟甲基苯肼(2NFPH)衍生化40 min，采用HPLC-MS技術(shù)測(cè)定孕烯醇酮(pregnenolone，PREG)

11、、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)、孕酮(progesterone，PROG)和別孕烯醇酮(allopregnanolone，AP)的含量。
　　6.星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB活性的檢測(cè)
　　6.1 免疫熒光法通過(guò)觀察免疫熒光染色的NF-κB主要功能性亞單位p65在細(xì)胞中的定位，反應(yīng)NF-κB的活性。取各處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞，4％多聚甲醛固定30 min，兔源p65(1∶100)4℃孵育過(guò)夜，

12、二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。
　　6.2 Western Blot分析通過(guò)Western Blot檢測(cè)p65在細(xì)胞核中的表達(dá)，反應(yīng)NF-κB的活性。取分組加藥處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞，冰上收集細(xì)胞，提取細(xì)胞核蛋白，-80℃，備用。等量蛋白提取液與上樣緩沖液混合，煮沸變性。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，100 mA濕轉(zhuǎn)，脫脂奶粉封閉，加兔源p65(1∶1000)孵育過(guò)夜，TBS漂洗后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，ECL光化

13、學(xué)法顯色，暗室中壓X光片顯影。X-光膠片經(jīng)掃描，應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件對(duì)掃描圖上的條帶進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　7.MTT法檢測(cè)神經(jīng)元存活率取出神經(jīng)元細(xì)胞爬片，放入24孔板中，每孔加入40μL MTT(5mg·mL-1)，于37℃孵育4h，棄去培養(yǎng)基，每孔各加入300μL DMSO，組細(xì)胞吸光度與對(duì)照組吸光度的比值表示相對(duì)細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果:
　　1.Aβ1-42對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響GFAP標(biāo)記的免疫熒光

14、染色，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。熒光顯微鏡下可見，對(duì)照組的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體飽滿，扁平，胞漿豐富，Aβ低劑量組胞體有輕微回縮，中劑量組胞體回縮，突起延展，高劑量組細(xì)胞突起明顯增多，延伸，細(xì)長(zhǎng)，呈星形放射狀。說(shuō)明Aβ1-42處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。
　　2.Aβ1-42對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AβM和AβH組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β水平均顯著升高(P＜0.05)，AβL、AβM和

15、AβH組細(xì)胞培養(yǎng)液中TNFα的水平均顯著升高(P＜0.05)。結(jié)果顯示Aβ1-42可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放。
　　3.Aβ1-42對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體水平的影響HPLC-MS法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Aβ1-42處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)甾體PROG水平下降43.8％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P＜0.05)，而PREG和DHEA水平均未見顯著變化（P＞0.05）。
　　4.PROG對(duì)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

16、ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，Aβ組星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液中IL-1β和TNFαα釋放均顯著升高(P＜0.01);與Aβ組相比，PM組、PH組IL-1β和TNFα的釋放均顯著下降（P＜0.05）;PL組IL-1β和TNFα的水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果顯示孕酮能夠濃度依賴的抑制Aβ引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放。
　　5.PROG對(duì)Aβ1-42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB活性的影響免疫熒光結(jié)果顯示，N

17、F-κB的主要功能亞單位p65在正常對(duì)照組細(xì)胞的胞質(zhì)明顯表達(dá)，胞核無(wú)著色;Aβ組NF-κB被激活，表現(xiàn)為p65核轉(zhuǎn)位，可見胞核深染，感光強(qiáng)。孕酮和Aβ1-42共同處理24 h，隨孕酮濃度的增加，p65在細(xì)胞核中的分布逐漸減少，胞質(zhì)中分布增多，孕酮濃度依賴的抑制Aβ1-42引起p65的核轉(zhuǎn)位。
　　Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Aβ組星形膠質(zhì)細(xì)胞核提取液中p65的表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，孕酮處理有效抑制Aβ1

18、-42引起的p65核轉(zhuǎn)位，與Aβ組相比，中、高劑量組細(xì)胞核提取液中p65表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，低劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，孕酮濃度依賴的抑制Aβ1-42活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的活性6孕酮抑制Aβ活化星形膠質(zhì)細(xì)胞所致神經(jīng)元損傷MTT結(jié)果顯示，Aβ活化星形膠質(zhì)細(xì)胞組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元存活率顯著下降，為對(duì)照組的70.1％(P＜0.05)。孕酮抑制Aβ活化星形膠質(zhì)細(xì)胞引起的神經(jīng)元存活率下降，作用呈濃度依賴性。與A

19、β組相比，孕酮中、高劑量組神經(jīng)元存活率顯著升高，分別為Aβ組的115.9％和129.6％（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.Aβ1-42處理濃度依賴的激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)為:1）胞體回縮、突起伸長(zhǎng)，呈星形放射狀;2）炎癥因子IL-1β和TNFα釋放水平升高;3)激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性。
　　2.Aβ1-42處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞可使其神經(jīng)甾體孕酮水平顯著下降，表明Aβ1-42可影響神經(jīng)甾體的水平。