孕酮抑制Aβ誘導的星形膠質細胞活化所致神經元損傷.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是人類最常見的年齡相關神經系統(tǒng)退行性疾病，是癡呆中最普遍的一種形式。其主要病理學變化包括:β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成老年斑(senile plaque，SP)、神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)、突觸缺失、神經元變性死亡以及星形膠質細胞過度活化和增生等。星形膠質細胞在AD的發(fā)生與發(fā)展過程中具有雙刃劍的作用，適度激

2、活的星形膠質細胞可胞吞Aβ蛋白，釋放神經營養(yǎng)因子，保護神經元，緩解AD的病理進展，但過度激活的星形膠質細胞，通過釋放神經毒性的細胞因子和其他毒性物質，促進神經元的凋亡。神經甾體(neurosteroid)是中樞神經系統(tǒng)中甾體類物質及其代謝產物的總稱，主要由膠質細胞和神經元合成，在中樞神經系統(tǒng)的功能調節(jié)中發(fā)揮廣泛作用。研究顯示，在多種神經退行性疾病中，神經甾體水平發(fā)生明顯變化，尤其AD患者腦脊液中PROG及AP水平與正常同齡人相比顯著下降

3、。本實驗室前期的研究發(fā)現在AD病理模型中，大鼠神經元的神經甾體合成代謝發(fā)生明顯變化，但是在AD病理模型下，星形膠質細胞神經甾體的合成代謝，以及神經甾體對星形膠質細胞與神經元交互作用中的影響尚未研究。因此本研究使用β淀粉樣蛋白構建AD樣細胞模型，檢測Aβ活化的星形膠質細胞合成代謝神經甾體的變化，進而確定與其活化關系密切的神經甾體，并闡述神經甾體對Aβ活化膠質細胞的影響，及其在膠質細胞與神經元交互作用中的影響。本研究為神經甾體在AD防治中的

4、應用提供實驗依據。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)
　　1.1 大鼠大腦星形膠質細胞原代培養(yǎng)取新生Spague-Dawley(SD)大鼠，無菌條件下取大腦皮質，剪碎，37℃水浴中胰酶消化15-20 min，含10％FBS的高糖Dulbecco's ModifiedEagle's Medium(DMEM)終止消化。使用巴氏吸管吹散細胞，制成單細胞懸液，接種于預先包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，37℃，5％ CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育

5、，每隔2-3 d全量更換培養(yǎng)液至細胞基本融合。使用‘二次震蕩法’純化星形膠質細胞，GFAP免疫熒光染色結果顯示星形膠質細胞純度超過95％。純化后星形膠質細胞經消化、重懸，以1×105個/mL密度接種于孔板中，含10％FBS的DMEM培養(yǎng)。
　　1.2 大鼠大腦皮質神經元培養(yǎng)取新生24 h內SD大鼠大腦皮質，胰蛋白酶消化輔以機械分離法分離細胞，懸浮于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，接種于預先包被多聚賴氨酸的玻片上，在37℃，5％

6、CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育，6h后首次換液為含2％B27的neurobasal培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后加入阿糖胞苷抑制膠質細胞生長，48 h以后完全換液，此后每兩天半量換液。取培養(yǎng)6-7 d的神經元細胞供實驗用。
　　1.3 星形膠質細胞與神經元共培養(yǎng)星形膠質細胞與神經元的共培養(yǎng)參照文獻方法略有改進，星形膠質細胞培養(yǎng)于處理過的六孔板中，每個孔底部含有4個約2mm高的石蠟小柱，用于支撐載玻片;神經元培養(yǎng)在經多聚賴氨酸處理的載破

7、片上，培養(yǎng)7天后，將載有神經元的玻片放入經不同藥物處理的星形膠質細胞進行共培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液為DMEM（不含Aβ、PROG），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。
　　2.實驗分組與給藥
　　2.1 Aβ1-42處理對星形膠質細胞的活化星形膠質細胞經不同濃度的Aβ1-42處理，隨機分為Control、AβL(1μM)、AβM（5μM）、AβH(10μM)四組，處理24 h，觀察星形膠質細胞形態(tài)，檢測炎癥因子的釋放。
　　2.2 Aβ1-4

8、2處理對星形膠質細胞神經甾體水平的影響星形膠質細胞經膽固醇和Aβ1-42處理，隨機分為空白組、Control組(膽固醇底物組，膽固醇濃度為10μM)、Aβ組（膽固醇+Aβ1-42，膽固醇和Aβ1-42濃度分別為10μM和5μM），處理24 h，檢測神經甾體的水平。
　　2.3 PROG處理對Aβ1-42活化星形膠質細胞的影響星形膠質細胞分別加入不同濃度PROG（0，0.01μM，0.1μM，1μM）與Aβ1-42（5μM），隨機分

9、為Control、Aβ、PL、PM、PH五組，共同處理24 h，用于檢測炎癥因子的釋放、NF-κB的活性及與神經元共培養(yǎng)實驗。
　　3.GFAP標記免疫熒光染色觀察星形膠質細胞的形態(tài)通過對GFAP（星形膠質細胞特異性中間纖維蛋白）免疫熒光染色，觀察星形膠質細胞的形態(tài)。各組細胞加藥處理后，取出細胞爬片，4％多聚甲醛固定30 min，兔源GFAP(1∶1000)4℃孵育過夜，二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。
　　4.ELISA測

10、定星形膠質細胞條件培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1β和TNFα的水平取各組細胞培養(yǎng)液，3000 rpm離心，取上清，按試劑盒說明書操作，酶標儀讀取數值。
　　5.HPLC-MS法測定星形膠質細胞神經甾體水平取各組細胞培養(yǎng)液，加入內標甲睪酮，用乙酸乙酯/正己烷萃取，合并有機相，50℃水浴下氮氣吹干，60℃水浴中2-硝基-4-三氟甲基苯肼(2NFPH)衍生化40 min，采用HPLC-MS技術測定孕烯醇酮(pregnenolone，PREG)

11、、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)、孕酮(progesterone，PROG)和別孕烯醇酮(allopregnanolone，AP)的含量。
　　6.星形膠質細胞中NF-κB活性的檢測
　　6.1 免疫熒光法通過觀察免疫熒光染色的NF-κB主要功能性亞單位p65在細胞中的定位，反應NF-κB的活性。取各處理組星形膠質細胞，4％多聚甲醛固定30 min，兔源p65(1∶100)4℃孵育過夜，

12、二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。
　　6.2 Western Blot分析通過Western Blot檢測p65在細胞核中的表達，反應NF-κB的活性。取分組加藥處理后星形膠質細胞，冰上收集細胞，提取細胞核蛋白，-80℃，備用。等量蛋白提取液與上樣緩沖液混合，煮沸變性。樣品經SDS-PAGE電泳分離，100 mA濕轉，脫脂奶粉封閉，加兔源p65(1∶1000)孵育過夜，TBS漂洗后加辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2h，ECL光化

13、學法顯色，暗室中壓X光片顯影。X-光膠片經掃描，應用ImageJ圖像分析軟件對掃描圖上的條帶進行相對定量分析。
　　7.MTT法檢測神經元存活率取出神經元細胞爬片，放入24孔板中，每孔加入40μL MTT(5mg·mL-1)，于37℃孵育4h，棄去培養(yǎng)基，每孔各加入300μL DMSO，組細胞吸光度與對照組吸光度的比值表示相對細胞存活率。
　　結果:
　　1.Aβ1-42對星形膠質細胞形態(tài)學的影響GFAP標記的免疫熒光

14、染色，觀察星形膠質細胞的形態(tài)。熒光顯微鏡下可見，對照組的星形膠質細胞胞體飽滿，扁平，胞漿豐富，Aβ低劑量組胞體有輕微回縮，中劑量組胞體回縮，突起延展，高劑量組細胞突起明顯增多，延伸，細長，呈星形放射狀。說明Aβ1-42處理后的星形膠質細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。
　　2.Aβ1-42對星形膠質細胞炎癥因子釋放的影響ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，AβM和AβH組細胞培養(yǎng)液中IL-1β水平均顯著升高(P＜0.05)，AβL、AβM和

15、AβH組細胞培養(yǎng)液中TNFα的水平均顯著升高(P＜0.05)。結果顯示Aβ1-42可以促進星形膠質細胞炎癥因子的釋放。
　　3.Aβ1-42對星形膠質細胞神經甾體水平的影響HPLC-MS法檢測結果顯示，與對照組相比，Aβ1-42處理的星形膠質細胞神經甾體PROG水平下降43.8％，具有統(tǒng)計學顯著差異(P＜0.05)，而PREG和DHEA水平均未見顯著變化（P＞0.05）。
　　4.PROG對活化星形膠質細胞炎癥因子釋放的影響

16、ELISA檢測結果顯示，與正常對照組相比，Aβ組星形膠質細胞條件培養(yǎng)液中IL-1β和TNFαα釋放均顯著升高(P＜0.01);與Aβ組相比，PM組、PH組IL-1β和TNFα的釋放均顯著下降（P＜0.05）;PL組IL-1β和TNFα的水平變化無統(tǒng)計學顯著差異（P＞0.05）。結果顯示孕酮能夠濃度依賴的抑制Aβ引起的星形膠質細胞炎癥因子的釋放。
　　5.PROG對Aβ1-42活化星形膠質細胞NF-κB活性的影響免疫熒光結果顯示，N

17、F-κB的主要功能亞單位p65在正常對照組細胞的胞質明顯表達，胞核無著色;Aβ組NF-κB被激活，表現為p65核轉位，可見胞核深染，感光強。孕酮和Aβ1-42共同處理24 h，隨孕酮濃度的增加，p65在細胞核中的分布逐漸減少，胞質中分布增多，孕酮濃度依賴的抑制Aβ1-42引起p65的核轉位。
　　Western blot結果顯示，與對照組相比，Aβ組星形膠質細胞核提取液中p65的表達顯著增加(P＜0.01)，孕酮處理有效抑制Aβ1

18、-42引起的p65核轉位，與Aβ組相比，中、高劑量組細胞核提取液中p65表達量顯著降低(P＜0.01)，低劑量組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結果表明，孕酮濃度依賴的抑制Aβ1-42活化星形膠質細胞中NF-κB的活性6孕酮抑制Aβ活化星形膠質細胞所致神經元損傷MTT結果顯示，Aβ活化星形膠質細胞組大鼠皮質神經元存活率顯著下降，為對照組的70.1％(P＜0.05)。孕酮抑制Aβ活化星形膠質細胞引起的神經元存活率下降，作用呈濃度依賴性。與A

19、β組相比，孕酮中、高劑量組神經元存活率顯著升高，分別為Aβ組的115.9％和129.6％（P＜0.05）。
　　結論:
　　1.Aβ1-42處理濃度依賴的激活星形膠質細胞，表現為:1）胞體回縮、突起伸長，呈星形放射狀;2）炎癥因子IL-1β和TNFα釋放水平升高;3)激活核轉錄因子NF-κB的活性。
　　2.Aβ1-42處理的星形膠質細胞可使其神經甾體孕酮水平顯著下降，表明Aβ1-42可影響神經甾體的水平。