瘤胃纖維降解菌Real-Time PCR熒光定量方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、對(duì)綿羊瘤胃主要的幾株纖維降解菌如產(chǎn)琥珀酸擬桿菌Fibrobactersuccinogenes、白色瘤胃球菌Rumincoccus albus、黃色瘤胃球菌Rumincoccusflavefacions和瘤胃厭氧真菌的Real-Time PCR熒光定量方法進(jìn)行研究，獲得如下結(jié)果： 1．DNA的提取采用珠磨-SDS/CTAB/PVP法。提取的瘤胃微生物總DNA在20Kb以上，OD<,260>/OD<,280>在1.7以上，經(jīng)過(guò)純化后

2、OD<,260>/OD<,280>均在1.8-2.0，利用真細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌16s/18SrDNA的通用引物從純化后瘤胃微生物總DNA中成功擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，表明珠磨式機(jī)械破碎法能充分破碎包括細(xì)菌、真菌等在內(nèi)的各種瘤胃微生物，并滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。 2．以16s/18SrDNA為靶序列，利用SYBR Green Ⅰ熒光染料Real-time PCR法成功對(duì)Fibrobacter succinogenes、Rumincoccus

3、albus、Rumincoccusflavefaciens和瘤胃厭氧真菌進(jìn)行了定量檢測(cè)，并構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)品，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率均在-3.0左右，有效檢測(cè)靈敏度可達(dá)10<'1>水平拷貝/20μL體系。對(duì)具體PCR條件進(jìn)行優(yōu)化后，分別在種和類的水平上，建立了采用SYBR Green Ⅰ熒光染料Real-Time PCR法對(duì)瘤胃主要纖維降解菌進(jìn)行絕對(duì)定量的方法，且較為快速和準(zhǔn)確。此外還對(duì)熒光定量Real-Time PCR法計(jì)數(shù)結(jié)果和傳統(tǒng)滾管計(jì)數(shù)

4、法進(jìn)行了相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了95.9％，證明了此方法在瘤胃纖維降解菌的計(jì)數(shù)方面具有較高的優(yōu)越性和實(shí)用性。 3．本試驗(yàn)還利用上述方法研究了不同精粗比日糧條件下瘤胃主要纖維降解菌區(qū)系和數(shù)量的變化。試驗(yàn)選用9只體況良好、體重50kg左右的蘇尼特綿羊隨機(jī)分為三組，每組3只。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組精粗比分別為1：9、2：8和5：5。通過(guò)應(yīng)用熒光定量Real-time PCR與傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法對(duì)瘤胃纖維降解菌和厭氧真菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果為兩種方法所得結(jié)

5、果具有一致性、變化趨勢(shì)相同。傳統(tǒng)方法試驗(yàn)條件下纖維降解菌群出現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，但是日糧纖維素含量對(duì)瘤胃真菌數(shù)量影響不顯著；而利用本試驗(yàn)所建立的熒光定量Real-time PCR法方法檢測(cè)到的結(jié)果可以看出，F(xiàn)ibrobacter succinogenes、Rummococcus flavefaciens和厭氧真菌受日糧粗纖維比例的影響顯著，只有Ruminococcus albus受影響不顯著，但是隨著粗纖維的增加仍具有明顯的增加趨勢(shì)。從本