一種新型神經(jīng)營養(yǎng)因子對缺糖、缺氧-再給氧損傷細胞模型的實驗研究.pdf

1、腦缺血-再灌注損傷被認為是導(dǎo)致缺血性腦卒中、溶栓治療及心、肺、腦復(fù)蘇后預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，其病理生理過程復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷后，機體能產(chǎn)生內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子參與修復(fù)損傷神經(jīng)。我們設(shè)想，在腦缺血-再灌注損傷發(fā)生過程中，如果有大量的外源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)參與，也許能有效減輕或逆轉(zhuǎn)腦缺血-再灌注損傷的病理過程。但是，外源性BDNF為大分子蛋白質(zhì)，外周途徑給藥困難，難以透過血腦屏障(BBB)。因此，如何能有效的使得外源性BD

2、NF透過血腦屏障成為研究的熱點。
　　 本研究首先以優(yōu)化了核苷酸序列的BDNF基因為模板，通過基因工程亞克隆技術(shù)修改pET-32a載體，構(gòu)建能在原核生物中融合表達的載體pET-PTD-BDNF，將載體導(dǎo)入到工程菌株BL21中，加入IPTG誘導(dǎo)表達。結(jié)果表明：所構(gòu)建的表達載體pET-PTD-BDNF完全正確。含有重組質(zhì)粒pET-PTD-BDNF的大腸桿菌BL21在IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE分析表明：pET-PTD-BDNF

3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達了PTD-BDNF融合蛋白，且為可溶性表達。經(jīng)Western blot進一步分析，表明獲得的融合蛋白為目的蛋白。
　　 其次，以SH-SY5Y細胞為研究對象，采用正交實驗設(shè)計測定了MTT比色法檢測的最優(yōu)條件：每孔細胞數(shù)：(0.2×108個/L，100μ1)，MTT的染色時間(6小時)，MTT的劑量(5g/L)。并以此條件檢測BDNF的生物學活性。當BDNF濃度為50μg·L-1時，再增加BDNF的濃度，細胞

4、吸光值并無顯著增加，能得到很好的量效關(guān)系。
　　 最后，建立了缺糖、缺氧-再給氧損傷SH-SY5Y神經(jīng)細胞模型，應(yīng)用顯微鏡觀察細胞形態(tài)、MTT比色法測定細胞存活率、苔盼藍染色排斥試驗檢測細胞活力、測定SH-SY5Y細胞LDH釋放率、Annexin V-FITC和PropidiumIodide雙染色法熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡以及流式細胞儀檢測細胞死亡和凋亡等方法，比較新型神經(jīng)營養(yǎng)因子PTD-BDNF、外源性BDNF(參考品)、基因

5、轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入表達BDNF的基因片段(pcDNA3.1/BDNF)三種不同途徑對缺糖、缺氧-再給氧損傷神經(jīng)細胞的保護作用。
　　 顯微鏡下觀察結(jié)果表明：在損傷模型組有大量的細胞死亡。而在BDNF、PTD-BDNF的預(yù)保護組和保護組中，細胞存活較多，且預(yù)保護組要優(yōu)于保護組。在轉(zhuǎn)染了表達BDNF基因的SH-SY5Y細胞上，經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后，再給予缺糖、缺氧-再給氧處理，其死亡、凋亡的細胞數(shù)和對照組相比明顯減少，和BDNF及PTD-BD

6、NF的預(yù)保護組相比，死亡、凋亡的細胞數(shù)并無顯著增加。
　　 在SH-SY5Y細胞存活率、死亡率、LDH釋放率的測定實驗中，損傷模型組細胞存活率較正常對照組明顯降低，而細胞死亡率、LDH釋放率明顯升高；BDNF、PTD-BDNF的預(yù)保護組和保護組均能提高細胞的存活率，降低細胞死亡率和LDH釋放率，且預(yù)保護組好于保護組?；蜣D(zhuǎn)染實驗分組中，轉(zhuǎn)染損傷模型+ATRA組與轉(zhuǎn)染損傷模型組相比較顯著提高了細胞的存活率，降低細胞死亡率和LDH釋