一種新型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)缺糖、缺氧-再給氧損傷細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦缺血-再灌注損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致缺血性腦卒中、溶栓治療及心、肺、腦復(fù)蘇后預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，其病理生理過(guò)程復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷后，機(jī)體能產(chǎn)生內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子參與修復(fù)損傷神經(jīng)。我們?cè)O(shè)想，在腦缺血-再灌注損傷發(fā)生過(guò)程中，如果有大量的外源性腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)參與，也許能有效減輕或逆轉(zhuǎn)腦缺血-再灌注損傷的病理過(guò)程。但是，外源性BDNF為大分子蛋白質(zhì)，外周途徑給藥困難，難以透過(guò)血腦屏障(BBB)。因此，如何能有效的使得外源性BD

2、NF透過(guò)血腦屏障成為研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究首先以優(yōu)化了核苷酸序列的BDNF基因?yàn)槟０?，通過(guò)基因工程亞克隆技術(shù)修改pET-32a載體，構(gòu)建能在原核生物中融合表達(dá)的載體pET-PTD-BDNF，將載體導(dǎo)入到工程菌株BL21中，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明：所構(gòu)建的表達(dá)載體pET-PTD-BDNF完全正確。含有重組質(zhì)粒pET-PTD-BDNF的大腸桿菌BL21在IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE分析表明：pET-PTD-BDNF

3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達(dá)了PTD-BDNF融合蛋白，且為可溶性表達(dá)。經(jīng)Western blot進(jìn)一步分析，表明獲得的融合蛋白為目的蛋白。
　　 其次，以SH-SY5Y細(xì)胞為研究對(duì)象，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)定了MTT比色法檢測(cè)的最優(yōu)條件：每孔細(xì)胞數(shù)：(0.2×108個(gè)/L，100μ1)，MTT的染色時(shí)間(6小時(shí))，MTT的劑量(5g/L)。并以此條件檢測(cè)BDNF的生物學(xué)活性。當(dāng)BDNF濃度為50μg·L-1時(shí)，再增加BDNF的濃度，細(xì)胞

4、吸光值并無(wú)顯著增加，能得到很好的量效關(guān)系。
　　 最后，建立了缺糖、缺氧-再給氧損傷SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞模型，應(yīng)用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率、苔盼藍(lán)染色排斥試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力、測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放率、Annexin V-FITC和PropidiumIodide雙染色法熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞死亡和凋亡等方法，比較新型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子PTD-BDNF、外源性BDNF(參考品)、基因

5、轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入表達(dá)BDNF的基因片段(pcDNA3.1/BDNF)三種不同途徑對(duì)缺糖、缺氧-再給氧損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 顯微鏡下觀察結(jié)果表明：在損傷模型組有大量的細(xì)胞死亡。而在BDNF、PTD-BDNF的預(yù)保護(hù)組和保護(hù)組中，細(xì)胞存活較多，且預(yù)保護(hù)組要優(yōu)于保護(hù)組。在轉(zhuǎn)染了表達(dá)BDNF基因的SH-SY5Y細(xì)胞上，經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后，再給予缺糖、缺氧-再給氧處理，其死亡、凋亡的細(xì)胞數(shù)和對(duì)照組相比明顯減少，和BDNF及PTD-BD

6、NF的預(yù)保護(hù)組相比，死亡、凋亡的細(xì)胞數(shù)并無(wú)顯著增加。
　　 在SH-SY5Y細(xì)胞存活率、死亡率、LDH釋放率的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，損傷模型組細(xì)胞存活率較正常對(duì)照組明顯降低，而細(xì)胞死亡率、LDH釋放率明顯升高；BDNF、PTD-BDNF的預(yù)保護(hù)組和保護(hù)組均能提高細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞死亡率和LDH釋放率，且預(yù)保護(hù)組好于保護(hù)組。基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組中，轉(zhuǎn)染損傷模型+ATRA組與轉(zhuǎn)染損傷模型組相比較顯著提高了細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞死亡率和LDH釋