黃芩苷對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧缺糖損傷的作用.pdf

1、缺氧缺糖(oxygen-glucosedeprivation，OGD)誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷，能模擬整體水平腦缺血損傷，廣泛用于研究離體水平腦缺血變化，并且用于離體水平評(píng)價(jià)藥物神經(jīng)保護(hù)作用。在OGD過(guò)程中，并沒(méi)有明確的方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，于是便出現(xiàn)了多種不同的實(shí)驗(yàn)方法，比如在缺氧條件、再灌注液體、OGD持續(xù)時(shí)間等方面有所不同；尤其在實(shí)驗(yàn)溶液的配制方面更是存在較大差異，而在OGD過(guò)程中實(shí)驗(yàn)溶液會(huì)直接影響神經(jīng)元的活性，因此，實(shí)驗(yàn)溶液的選擇就顯得尤為

2、重要。本研究的第一部分，旨在尋找出最適合誘導(dǎo)OGD損傷及評(píng)價(jià)藥物作用的實(shí)驗(yàn)溶液。 5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)是花生四烯酸代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在它的作用下花生四烯酸代謝成為前列腺素、白三烯等一系列炎癥介質(zhì)，白三烯類(leukotrienes，LTs)包括白三烯B4(LTB4)和半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括LTC4、LTD4和LTE4)，它們均是體內(nèi)很

3、強(qiáng)的炎癥介質(zhì)。5-脂氧酶參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，諸如腦缺血、腦外傷和腦腫瘤。而抑制5-脂氧酶活性，減少其代謝產(chǎn)物(主要是白三烯物質(zhì))的生成，有助于發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。 黃芩苷是一種重要的黃酮類化合物，具有多種藥理學(xué)作用，如清除自由基、抗氧化、抗炎、抗病毒、擴(kuò)血管作用等。然而，其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全闡明，特別對(duì)5-脂氧酶活性有無(wú)影響，尚不清楚。 因此，本研究的主要目的為觀察黃芩苷、5-脂氧酶抑制劑咖啡酸(ca

4、ffeicacid)對(duì)大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元缺血樣損傷以及5-脂氧酶激活的作用。 第一部分缺氧缺糖損傷模型的建立——不同實(shí)驗(yàn)溶液對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧缺糖損傷的影響 目的：觀察不同實(shí)驗(yàn)溶液對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧缺糖(OGD)損傷和陽(yáng)性對(duì)照藥依達(dá)拉奉(edaravone)神經(jīng)保護(hù)作用的影響，找出最適宜誘導(dǎo)神經(jīng)元OGD損傷的實(shí)驗(yàn)溶液。 方法：原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，用不同的實(shí)驗(yàn)溶液誘導(dǎo)皮質(zhì)神

5、經(jīng)元OGD損傷，噻唑藍(lán)(MTT)染色和乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定觀察神經(jīng)元活性的變化?？鼓X缺血損傷藥物依達(dá)拉奉(edaravone)在OGD30min前加入神經(jīng)元培養(yǎng)液中，并維持在OGD及再灌注全過(guò)程中，觀察其對(duì)在不同實(shí)驗(yàn)溶液中誘導(dǎo)的神經(jīng)元OGD損傷的作用。 結(jié)果：(1)MTT測(cè)定提示OGD損傷具有時(shí)間依賴性，隨著OGD時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)元損傷加重。(2)pH值為7.8的實(shí)驗(yàn)溶液(S4)引起神經(jīng)元損傷最大，使神經(jīng)元存活率降低；pH

6、值為7.4和6.1的實(shí)驗(yàn)溶液(S3和S1)分別使神經(jīng)元存活率降低31％和21％，LDH釋放增加66％和65％；而pH值為6.5的實(shí)驗(yàn)溶液(S2)引起神經(jīng)元損傷最小。依達(dá)拉奉(1μmol/L)能夠顯著逆轉(zhuǎn)在pH值為6.1、7.4和7.8的實(shí)驗(yàn)溶液(S1、S3和S4)中OGD誘發(fā)的神經(jīng)元存活率下降和LDH釋放增加，且在pH值為7.4的實(shí)驗(yàn)溶液(S3)中最為有效，而在pH值為6.5的實(shí)驗(yàn)溶液(S2)中則無(wú)保護(hù)作用。(3)在含1.8mmol/L

7、Mg2+的實(shí)驗(yàn)溶液(S5)中，OGD引起的神經(jīng)元損傷比在僅含0.8mmol/LMg2+的實(shí)驗(yàn)溶液(S3)中誘導(dǎo)的損傷輕。依達(dá)拉奉(1μmol/L)能夠逆轉(zhuǎn)在含0.8mmol/LMg2+的實(shí)驗(yàn)溶液(S3)中OGD誘發(fā)的神經(jīng)元損傷；而對(duì)在含1.8mmol/LMg2+的實(shí)驗(yàn)溶液(S5)中誘發(fā)的損傷無(wú)明顯作用。(4)在含10μmol/L甘氨酸的實(shí)驗(yàn)溶液(S6)中，OGD引起的神經(jīng)元損傷比在不含甘氨酸的實(shí)驗(yàn)溶液(S3)中誘導(dǎo)的損傷重。依達(dá)拉奉(1

8、μmol/L)能夠逆轉(zhuǎn)在含或不含10μmol/L甘氨酸的實(shí)驗(yàn)溶液(S5或S3)中OGD誘發(fā)的神經(jīng)元損傷；但在不含甘氨酸的實(shí)驗(yàn)溶液(S3)中保護(hù)作用更強(qiáng)。(5)在含0.9mmol/LCa2+的實(shí)驗(yàn)溶液(S7)中，OGD引起的神經(jīng)元損傷比在含1.8mmol/LCa2+的實(shí)驗(yàn)溶液(S3)中誘導(dǎo)的損傷輕。依達(dá)拉奉(1mol/L)能逆轉(zhuǎn)在含1.8mmol/LCa2+的實(shí)驗(yàn)溶液(S3)中OGD誘發(fā)的神經(jīng)元損傷；而對(duì)在僅含0.9mmol/LCa2+的

9、實(shí)驗(yàn)溶液(S7)中誘發(fā)的損傷無(wú)保護(hù)作用。 結(jié)論：(1)在不同實(shí)驗(yàn)溶液(pH值及組成成分不同)，OGD誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元損傷差異較大；同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照藥依達(dá)拉奉對(duì)不同實(shí)驗(yàn)溶液誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元OGD損傷的作用也存在較大的差異。(2)最適合誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元OGD損傷的實(shí)驗(yàn)溶液，是pH值為7.2～7.4的無(wú)糖Earle's液。本研究在實(shí)驗(yàn)溶液的酸堿度及組成成分方面，對(duì)神經(jīng)元OGD損傷模型作了較大改進(jìn)，完善了離體水平模擬腦缺血性損傷、研究

10、藥物作用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?第二部分黃芩苷減輕缺氧缺糖誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷并抑制5-脂氧酶激活 目的：觀察黃芩苷對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧缺糖(OGD)損傷究竟有無(wú)神經(jīng)保護(hù)作用；如果有保護(hù)作用，是否與抑制5-LOX激活有關(guān)。 方法：皮質(zhì)神經(jīng)元給予OGD1.5h再灌注24h處理，黃芩苷、5-LOX抑制劑咖啡酸以及NMDA受體拮抗劑MK-801，在OGD前30min加入神經(jīng)元培養(yǎng)液中，并維持在OGD及再灌注全過(guò)程中。

11、MTT用于檢測(cè)神經(jīng)元的存活率；PI和Hoechst33258染色用于觀察神經(jīng)元壞死和凋亡情況；免疫細(xì)胞化學(xué)用于觀察5-LOX的亞細(xì)胞分布以及OGD損傷后的變化；酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒用于測(cè)定OGD引起的半胱氨酰白三烯產(chǎn)物的生成；熒光試劑Fluo-3/AM用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣水平。 結(jié)果：(1)黃芩苷(1～5μmol/L)、咖啡酸(5～25μmol/L)和MK-801(1～10μmol/L)，能夠濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)OGD引起的神經(jīng)元死亡。(

12、2)5μmol/L黃芩苷、5μmol/L咖啡酸和5μmol/LMK-801能有效抑制OGD引起的神經(jīng)元數(shù)量減少，并減輕神經(jīng)元壞死。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫雙熒光染色結(jié)果顯示，在靜息神經(jīng)元中5-LOX均勻地分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及突起上；OGD1.5h再灌注1h后，大約有50％的神經(jīng)元中5-LOX轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核膜；5μmol/L黃芩苷和5μmol/LMK-801能夠抑制5-LOX核膜移位，而5μmol/L咖啡酸則不能。(4)OGD1.5h再

13、灌注0.5h至1.5h條件下，5-LOX產(chǎn)物CysLTs生成有所增加，其中再灌1h時(shí)達(dá)到最高峰；5μmol/L黃芩苷、5μmol/L咖啡酸和5μmol/LMK-801顯著抑制了OGD誘導(dǎo)的CysLTs增多；與此同時(shí)，咖啡酸還進(jìn)一步降低了CysLTs產(chǎn)物的基線水平。(5)黃芩苷(1～5μmol/L)和MK-801(5μmol/L)能顯著抑制谷氨酸引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高，而咖啡酸(1～25μmol/L)則無(wú)此作用。 結(jié)論： (1