KA-01抗乙型肝炎病毒及機(jī)理研究.pdf

1、病毒性肝炎是嚴(yán)重危害人類身體健康的慢性傳染病之一,全世界約有4億人為乙肝病毒慢性感染者,主要分布在亞、非國家。我國是病毒性肝炎高發(fā)地區(qū),以HBV感染為主。流行病學(xué)資料表明,我國有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶者1.2億人,約有3000萬慢性乙型肝炎患者需要治療。盡管乙肝疫苗已廣泛使用,在一定程度上對(duì)乙肝有預(yù)防作用,但也存在不應(yīng)答和不良反應(yīng)。此外,慢性乙肝病人經(jīng)5～20年后約有12％可發(fā)展為肝硬化,在肝硬化病人中大約20％患者最后發(fā)展

2、為肝功能衰竭,約5％發(fā)展為肝癌。全世界每年死于HBV相關(guān)疾病者為2713萬人,因此,WHO已把乙型肝炎列為第九大死因。 目前臨床雖有眾多藥物用于慢性病毒性肝炎的治療,包括抗病毒藥、保肝(抗纖維化)藥、免疫調(diào)控劑和中草藥等,但仍存在諸多問題?？挂腋尾《舅幬镏饕院塑疹愃莆锛案蓴_素為主,其中核苷類藥物雖具有一定的抗病毒作用,但其對(duì)共價(jià)閉環(huán)HBV DNA的清除作用尚不確定,停藥后易反彈,且用藥后可發(fā)生不同程度的病毒變異,影響臨床長期應(yīng)

3、用。而干擾素的有效率在30-50％之間,且有一定的副作用。中藥、免疫調(diào)控劑及保肝藥對(duì)緩解臨床癥狀,改善肝功能和抑制病毒復(fù)制也有一定療效,但也存在個(gè)體差異大、療效弱及反跳率高等不足。因此,研究高效,安全、反跳率低和不良反應(yīng)小的新藥尤其是具有病毒清除作用的藥物仍是病毒性肝炎治療的重要途徑和關(guān)鍵所在。 慢性肝炎的臨床治療仍以藥物為主,用藥特點(diǎn)為種類多,用藥周期長(數(shù)月或常年)和反復(fù)應(yīng)用。目前我國每年用于慢性肝炎治療的費(fèi)用約100億,并

4、以約15％速度逐年遞增。上述治療藥物中化學(xué)藥物約占70％(其中抗病毒藥約占40％),中藥約占30％。由此可見,慢性病毒性肝炎的治療不僅給國家和患者家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān),同時(shí)也引起就業(yè)、升學(xué)等嚴(yán)重社會(huì)問題。 目前我國臨床應(yīng)用的抗病毒藥多為國外藥廠產(chǎn)品,具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗肝炎藥寥寥無幾。面對(duì)慢性肝炎如此巨大的用藥人群和隨之帶來的用藥負(fù)擔(dān),研究具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、高效、低毒、價(jià)格合適的抗肝炎新藥不僅具有重大的社會(huì)意義,

5、同時(shí)可產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益。中藥復(fù)方KA-01由多種中藥提取而成。本研究首先確定KA-01體內(nèi)外抗HBV的作用,之后探討其作用機(jī)理。以HBV生命周期中起關(guān)鍵作用的蛋白為靶點(diǎn),利用BIAcore技術(shù)有目的地在中藥復(fù)方中分析其有效部位和有效成分。 一.中藥復(fù)方KA-01抗HBV的作用 為確定KA-01體外抗HBV的作用,采用HepG 2.2.15細(xì)胞模型,測(cè)定中藥復(fù)方KA-01對(duì)細(xì)胞的最大無毒劑量是100μg/ml。ELISA

6、法檢測(cè)KA-01體外抗HBV活性,最大無毒劑量時(shí)KA-01對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分別為62.01％和30.59％,有明顯作用。鴨乙肝模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,KA-01也可降低鴨乙肝動(dòng)物血清中DHBV DNA水平。提示KA-01在體內(nèi)外有抗HBV作用。 二.中藥復(fù)方KA-01作用機(jī)理的探討 利用BIAcore技術(shù)、熒光定量PCR、激光共聚焦顯微鏡等方法對(duì)其機(jī)理進(jìn)行探討,BIAcore技術(shù)初步研究結(jié)果表

7、明:KA-01與乙肝病毒結(jié)合靶點(diǎn)為HBsAg,而不是HBeAg。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KA-01不僅對(duì)HBsAg有抑制作用,而且對(duì)HBeAg也有一定抑制作用,分析KA-01對(duì)HBeAg的抑制作用是通過其它途徑。熒光定量PCR結(jié)果表明KA-01對(duì)HBV DNA有抑制作用,KA-01 100μg/ml組抑制率為24.86％。激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步顯示KA-01可降低HBsAg,而在低于20μg/ml后與細(xì)胞對(duì)照組沒有明顯差異。

8、三.中藥復(fù)方KA-01有效部位的研究 應(yīng)用BIAcore技術(shù)分析KA-01及其主要組分A、B、C、D在相同條件下,與HBsAg及HBeAg蛋白靶點(diǎn)結(jié)合。并進(jìn)一步應(yīng)用HepG2.2.15細(xì)胞模型,ELISA法測(cè)定體外抗HBV活性。BIAcore研究結(jié)果顯示:KA-01及其四種主要組分與HBsAg蛋白結(jié)合的響應(yīng)值分別為228.2、183.7、162.1、39.1、66.6 RU,與HBeAg蛋白幾乎沒有結(jié)合。在最大無毒劑量時(shí)KA-0

9、1、A、B、C對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg抑制率分別為62.01％、54.26％、50.97％和17.54％,KA.01及其四種主要組分與HBsAg蛋白結(jié)合的響應(yīng)值由大到小依次為KA-01、A、B、C。它們對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制效果也依次為KA-01及A、B和C。A為KA-01中的有效部位。 對(duì)KA-01中的有效部位A進(jìn)行體內(nèi)外抗HBV活性研究。最大無毒劑量時(shí)A對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑

10、制率分別為54.26％和14.15％。提示A在體外有抗HBV作用。體內(nèi)抗HBV活性以鴨乙型肝炎病毒感染雛鴨模型,斑點(diǎn)雜交法觀察其體內(nèi)對(duì)鴨血清DHBV DNA水平的影響,Southern雜交法測(cè)定其對(duì)鴨肝組織中DHBV DNA水平的影響。DHBV感染雛鴨7天血清檢測(cè)為陽性后,DHBV DNA感染鴨分為五組：鹽水組,拉米夫定組,A藥高劑量組(0.8g/kg/天),A藥中劑量組(0.4g/kg/天),A藥低劑量組(0.2g/kg/天)。灌胃給

11、藥,1天2次連續(xù)給藥10天。給藥前(T0),給藥第5,10天(T5,T10)與停藥后3天(P3)取血,DHBV DNA斑點(diǎn)雜交。拉米夫定組給藥第5,10天(T5,T10)與給藥前(T0)的OD值比較,鴨血清DHBV DNA水平明顯下降,有非常顯著性和顯著性意義(P<0.01,0.05)。對(duì)鴨血清DHBV DNA抑制率與病毒對(duì)照組比較,給藥第5天,有非常顯著性差異(P<0.01)。A藥0.8g/kg/天組給藥后第5天(T5)和10天(T1

12、0)和停藥后3天(P3)對(duì)鴨血清DHBV DNA有顯著性意義(P<0.05)。0.4g/kg/天組,給藥后第5天(T5)和10天(T10)和停藥后3天(P3)對(duì)鴨血清DHBV DNA有一定作用。0.2g/kg/天組,給藥后第5天(T5)和10天(T10)和停藥后3天(P3)對(duì)鴨血清DHBV DNA無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。停藥后拉米夫定組有反彈,而A藥0.8g/kg/天組反彈不明顯。Southern雜交法檢測(cè)藥物治療鴨肝組織中的DHBV DNA,結(jié)

13、果顯示,肝組織中總DHBV DNA量沒有明顯減少。拉米夫定組感染鴨肝組織中總DHBV DNA量雖有所減少,但OD值結(jié)果比較顯示,拉米夫定組與鹽水組比較鴨肝組織中總DHBV DNA量無顯著性差異。A藥組鴨肝組織中總DHBV DNA量無明顯變化。A可降低鴨乙肝動(dòng)物血清中DHBV DNA水平,但對(duì)鴨肝組織中總DHBV DNA量無明顯影響。提示A在體內(nèi)外有抗HBV作用。 四.中藥復(fù)方KA-01有效成分的研究 進(jìn)一步分析有效成分,

14、以HBsAg蛋白為靶點(diǎn),BIAcore技術(shù)對(duì)A的單體A1、A2、A3和A4進(jìn)行分析,并進(jìn)行體外抗乙型肝炎病毒的研究。A1、A2、A3和A4與HBsAg蛋白結(jié)合的響應(yīng)值分別為61.8、44.9、163.0、75.5(RU)。提示A3在體外有抗HBV作用。 本論文對(duì)復(fù)方藥物KA-01體外實(shí)驗(yàn)表明,KA-01在體外有抗HBV作用。BIAcore技術(shù)、熒光定量PCR、激光共聚焦顯微鏡初步研究結(jié)果:KA-01與乙肝病毒結(jié)合靶點(diǎn)為HBsAg