含人MxA基因重組腺病毒抗乙型肝炎病毒作用研究.pdf

1、第一部分：人類(lèi)MxA基因的克隆與序列分析。 目的：從健康中國(guó)人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆人類(lèi)MxA基因，為下一步構(gòu)建重組腺病毒打下基礎(chǔ)。 方法：從健康中國(guó)人外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA，以總RNA為模板，根據(jù)GenBank中的MxA序列設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增MxA基因的特異性引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出目的基因。目的基因經(jīng)純化后定向克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrack-MxA，選取鑒定正確的

2、克隆測(cè)序，并應(yīng)用DNASIS2．1軟件對(duì)序列與已知GenBank中的MxA基因序列進(jìn)行同源性分析。 結(jié)果：重組質(zhì)粒pAdTrack-MxA構(gòu)建成功，測(cè)序結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所克隆片段長(zhǎng)2012bp，包含人MxA基因序列。分析表明與GenBank中人MxA基因序列同源性達(dá)99．75％，僅有5個(gè)堿基不同，且所編碼的氨基酸僅1個(gè)發(fā)生改變，此氨基酸位于MxA蛋白的非功能區(qū)。 結(jié)論：我們成功克隆了中國(guó)人MxA基因，同源性分析表明，可以以

3、此為模板，構(gòu)建重組腺病毒。 第二部分：含人MxA基因重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建。 目的：在成功克隆人類(lèi)MxA基因的基礎(chǔ)上，應(yīng)用腺病毒載體系統(tǒng)AdEasysystem構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdMxA。 方法：先將重組質(zhì)粒pAdTrack-MxA擴(kuò)增，以堿裂解法提取質(zhì)粒，以PmeI酶切使之線(xiàn)性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在BJ5183細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組以構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdMxA。重組腺病毒質(zhì)粒pAdMxA經(jīng)卡

4、那霉素抗性鑒別和PacI酶切確證，然后將pAdMxA以PmeI線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中包裝成完整的重組腺病毒顆粒AdMxA，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)并檢測(cè)重組腺病毒AdMxA的感染滴度。 結(jié)果：重組腺病毒質(zhì)粒pAdMxA經(jīng)PacI酶切后可見(jiàn)一條約4．Skb和另一條約30kb的條帶，表明同源重組成功。重組腺病毒質(zhì)粒pAdMxA經(jīng)293細(xì)胞包裝后可觀察到綠色熒光，收獲病毒并測(cè)定感染滴度為1．59×108(pfu／m1)，具有較高感染

5、效率。 結(jié)論：重組腺病毒AdMxA構(gòu)建成功，為下一步進(jìn)行慢性HBV感染的基因治療等研究奠定了基礎(chǔ)。 第三部分：重組腺病毒AdMxA抗HBV初步研究 目的：研究重組腺病毒AdMxA體外抗HBV作用效果，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。 方法：1．以重組腺病毒AdMxA的不同MOI轉(zhuǎn)染HepG2．2．15細(xì)胞，利用RT-PCR方法檢測(cè)HepG2．2．15細(xì)胞內(nèi)MxAmRNA水平的表達(dá)。 2．以重

6、組腺病毒AdMxA的不同MOI轉(zhuǎn)染HepG2．2．15細(xì)胞，利用ELASE方法檢測(cè)HepG2．2．15細(xì)胞內(nèi)HBsAg、HBeAg水平的變化。 結(jié)果： 1．RT—PCR結(jié)果：HepG2．2．15細(xì)胞經(jīng)重組腺病毒AdMxA轉(zhuǎn)染后，胞內(nèi)MxAmRNA水平均較未轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯升高。 2．ELASE檢測(cè)結(jié)果：HepG2．2．15細(xì)胞經(jīng)重組腺病毒AdMxA轉(zhuǎn)染后，胞內(nèi)HBsAg、HBeAg水平均較未轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯降低，有統(tǒng)