EBVBARF1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在胃癌細(xì)胞系SGC-7901中的表達(dá).pdf

1、目的：探討EBV-BARFl基因?qū)ξ干掀ぜ?xì)胞增殖能力的影響，為進(jìn)一步闡明EBV相關(guān)胃癌的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法： (1)根據(jù)GenBank提供的BARFl基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增BARF1的ORF，克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a，雙酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行序列測(cè)定。再將其插入真核表達(dá)載體pSG5中，轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E coli DH5a，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選和雙酶切鑒定插入方向。

2、 (2)將重組表達(dá)質(zhì)粒pSG5-BARFl及pSG5載體對(duì)照以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC-7901，以RT-PCR法檢測(cè)目的基因BARF1的表達(dá)，細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果： (1)RT-PCR獲得696bp的BARF1基因，經(jīng)限制性酶切鑒定證實(shí)成功插入pGEM-T載體中，經(jīng)雙酶切鑒定和DNA序列測(cè)定證實(shí)成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pSG5-BARF1。 (2)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC-7901后通過(guò)RT-PCR