轉(zhuǎn)導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化的研究.pdf

1、目的: 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）可被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞，被認(rèn)為是組織工程種子細(xì)胞的重要來源。在體外培養(yǎng)時(shí)，hBMSCs壽命有限，隨傳代次數(shù)增加其分化能力逐漸喪失，這限制了其在組織工程中的研究和運(yùn)用。轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展，使永生化細(xì)胞建立成為可能。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因轉(zhuǎn)入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，以建立永生化的入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 方法: 通過脂質(zhì)體將含有hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載

2、體（pLEGFP-C1-hTERT）轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞PT67，G418篩選出表達(dá)病毒的陽性細(xì)胞克隆。選取3個(gè)細(xì)胞克隆，各自進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。通過NIH 3T3對(duì)選取細(xì)胞的上清進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，確定最高病毒滴度。提取并擴(kuò)增hBMSCs，用病毒滴度最高的上清感染第三代（P3）hBMSCs。G418篩選感染后的細(xì)胞，選取3個(gè)單克隆分別進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。通過RT-PCR和Western Blot測(cè)定hTERT基因是否轉(zhuǎn)入hBMSCs中并表達(dá)。對(duì)P3轉(zhuǎn)導(dǎo)后的

3、hBMSCs （hTERT-hBMSCs）在形態(tài)學(xué)，細(xì)胞表型，向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)方面研究證明hTERT-hBMSCs仍保持轉(zhuǎn)導(dǎo)前的特性。通過MTT法測(cè)繪轉(zhuǎn)導(dǎo)前后hBMSCs生長(zhǎng)曲線，觀察hTERT基因轉(zhuǎn)入后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。通過TRAP-ELISA對(duì)hTERT-hBMSCs中端粒酶活性進(jìn)行檢測(cè)；通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)hTERT-hBMSCs致瘤性方面進(jìn)行研究。 結(jié)果: 通過RT-PCR和Western Blot檢測(cè)，轉(zhuǎn)

4、導(dǎo)后hBMSC中有hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，而未轉(zhuǎn)導(dǎo)hBMSC中雖可測(cè)到hTERT基因弱的mRNA轉(zhuǎn)錄，但是沒有測(cè)到蛋白的翻譯。hTERT-hBMSCs在形態(tài)學(xué)上和hBMSC一樣呈長(zhǎng)梭形，但是由于轉(zhuǎn)導(dǎo)有EGFP基因，前者有綠色熒光蛋白表達(dá)。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)前后hBMSC表面抗原標(biāo)記：CD29，CD71，CD106，CD45和CD34，結(jié)果為前三項(xiàng)抗原都是陽性，后兩項(xiàng)為陰性。在功能學(xué)方面，通過向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)，免疫細(xì)胞

5、化學(xué)檢測(cè)到轉(zhuǎn)導(dǎo)前后的細(xì)胞都呈棕黃色，說明有軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)記Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。TRAP-ELISA檢測(cè)到hTERT-hBMSCs中端粒酶活性，而沒有測(cè)到未轉(zhuǎn)導(dǎo)hBMSC中端粒酶活性。hTERT-hBMSCs增殖能力增加，現(xiàn)其傳代數(shù)在50代以上。在體外平板克隆培養(yǎng)中，hTERT-hBMSCs和hBMSCs細(xì)胞克隆形成不僅數(shù)量少，而且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差，克隆形成率為0.83%和0.67%，低于正常細(xì)胞克隆形成率1%，而對(duì)照組惡性黑色素瘤細(xì)胞克隆

6、數(shù)量多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，克隆形成率為57.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤細(xì)胞克隆形成率10%。在裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)中，陽性對(duì)照惡性黑色素瘤細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下，三周后局部就形成的腫塊，HE染色為惡性黑色素瘤細(xì)胞，而注射有hTERT-hBMSCs的部位觀察兩月未見腫物形成，局部皮下組織HE染色為皮下疏松結(jié)締組織。 結(jié)論: hTERT基因成功導(dǎo)入hBMSCs后不改變hBMSCs細(xì)胞形態(tài)，表面標(biāo)記和分化功能，保持其向軟骨細(xì)胞分化的能力。hTERT基因