構(gòu)建端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是來源于骨髓的非造血干細(xì)胞，能跨越胚層限制分化為神經(jīng)細(xì)胞。其既具有干細(xì)胞的一般特性，又具有取材方便、可用于自體移植、不存在倫理道德問題、易于外源性基因的轉(zhuǎn)染等優(yōu)點(diǎn)，使其具有廣闊的研究與應(yīng)用前景，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)研究與基因治療較為理想的工程細(xì)胞。然而，MSC的生命周期是有限的，在體外培養(yǎng)的條件下，大約傳代20代后即開始衰老，這一缺陷限制了對MSC的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。同

2、時，細(xì)胞衰老問題一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)，也是阻礙人類生物學(xué)和組織工程學(xué)研究的難點(diǎn)。目前促使細(xì)胞永生化主要是通過應(yīng)用病毒、放射性因素、癌基因及原癌基因、端粒酶等手段。其中以導(dǎo)入外源性端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)的技術(shù)最為常見。導(dǎo)入hTERT可誘導(dǎo)端粒酶活性，使端粒保持長度穩(wěn)定，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，從而大大延長其體外培養(yǎng)的壽命。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建hTERT真核

3、表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染MSC，為進(jìn)一步建立永生化間充質(zhì)干細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．hTERT基因的克隆從人食管癌組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為eDNA，PCR擴(kuò)增得到hTERT基因，回收純化；以T4連接酶連接hTERT基因片段和pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5 a后經(jīng)藍(lán)白篩選和以T7/SP6為引物PCR擴(kuò)增篩選鑒定重組克隆。 2．hTERT真核表達(dá)載體的構(gòu)建接種pGEM-T-hTERT重組質(zhì)粒于LB

4、(Amp<'+>)液體培養(yǎng)基，提取此重組質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ對其和pcDNA3.1質(zhì)粒載體酶切，分別回收純化，得到hTERT基因雙粘片段和pcDNA3.1線性質(zhì)粒。羥基化雙粘pcDNA3.1并進(jìn)行自身環(huán)化試驗(yàn)后，以T4連接酶將hTERT基因雙粘片段和pcDNA3.1線性質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5 a。PCR正反鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hTERT。 3．hTERT真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)

5、胞用非脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染劑Fugene6轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hTERT。G418篩選陽性細(xì)胞克隆，挑選單克隆擴(kuò)大再培養(yǎng)。 結(jié)果： 1．hTERT基因的克隆RT-PCR擴(kuò)增得到的cDNA片段為3363bp，與GenBank中hTERT基因cDNA長度一致。hTERT基因cDNA片段與克隆載體pGEM-T Easy連接后轉(zhuǎn)化，經(jīng)藍(lán)白篩選得到大量菌落，以T7/SP6為引物PCR擴(kuò)增鑒定得到陽性重組克隆pGEM-T-hTE

6、RT。 2．hTERT基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建酶切pGEM-T-hTERT和pcDNA3.1后得到的hTERT雙粘片段及pcDNA3.1線性質(zhì)粒，連接后經(jīng)轉(zhuǎn)化得到大量菌落，通過PCR正反鑒定得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hTERT。 3．hTERT基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以非脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染劑Fugene6將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hTERT轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。G418篩選出陽性克隆，提示hTERT基因片