miR-519-520家族下調(diào)人牙周膜細(xì)胞MMP-2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的及意義:
　　最初基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)被描述為細(xì)胞外基質(zhì)基板,后因其結(jié)構(gòu)和功能特性定義為一類酶家族。其主要分為三類:膠原酶;明膠酶和基質(zhì)溶解酶。大量研究表明,膠原酶存在于牙周炎患者的唾液和組織中,并隨著炎癥程度加重而增加,其中最為顯著的是MMP-2,牙周炎經(jīng)過有效治療MMP-2表達(dá)明顯降低。但對(duì)于靶向調(diào)控MMP-2上游位點(diǎn)還未見報(bào)道,目前隨著miRNAs的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展,為牙

2、周炎的研究開辟了新的思路。
　　miRNAs是由21~24核苷酸所組成并且存在于真核細(xì)胞當(dāng)中的一個(gè)非編碼小分子RNA,通過抑制蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯來調(diào)節(jié)細(xì)胞行為。miRNAs不僅在細(xì)胞凋亡、遷移、增殖、分化等生理過程中發(fā)揮作用,也與炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。研究表明,miRNAs具有炎癥負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,如在牛皮癬患者中觀察到miR-181b可以通過抑制核因子NF-ΚB表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),同時(shí)炎癥性刺激也可減少miR-181b的表達(dá)

3、。作為機(jī)體內(nèi)源性小RNA,miRNAs很可能在牙周炎發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用。
　　牙周膜細(xì)胞(peridontal ligament cells,PDLCs)是由Arnold發(fā)現(xiàn)的,其來源于牙周組織,是牙周結(jié)締組織的主要間質(zhì)細(xì)胞,在牙周組織的形成和再生過程中起著關(guān)鍵作用,PDLCs的增殖和分化在組織再生和修復(fù)過程中起重要作用,而PDLCs的凋亡是牙周破壞和修復(fù)的重要病理生理過程。
　　我們假設(shè)miRNAs可通過調(diào)控MM

4、P-2的表達(dá)影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展。實(shí)驗(yàn)通過生物學(xué)信息方法預(yù)測可調(diào)控MMP-2的miRNAs,并用qRT-PCR和Westernblot驗(yàn)證在牙周膜細(xì)胞中miRNA對(duì)MMP-2mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控關(guān)系,用雙熒光素酶驗(yàn)證miRNA是否作用于MMP-23’UTR的靶位點(diǎn)。
　　研究方法及步驟:
　　1、生物學(xué)信息檢測:通過DIANA-microT;TargetScan和miRanda;PITA四種在線預(yù)測軟件預(yù)測可能靶向于MM

5、P-23’UTR的miRNAs,以四個(gè)預(yù)測軟件綜合結(jié)果和總分靠前為原則。
　　2、人PDLCs培養(yǎng)與鑒定:在重慶第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔科門診采集因正畸需要拔除的健康、無齲壞的上頜前磨牙,用酶消化組織塊法分離細(xì)胞并常規(guī)培養(yǎng);倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及其變化;取第2代細(xì)胞進(jìn)行免疫組化法檢測細(xì)胞表型。
　　3、驗(yàn)證miRNAs對(duì)MMP-2調(diào)控:PDLCs被mimics-miRNAs和miRNAs negative con

6、trol(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染后,通過qRT-PCR和Western blot檢測細(xì)胞中MMP-2mRNA和western blot表達(dá)的改變,通過雙熒光素酶驗(yàn)證基因的靶點(diǎn),MMP-2野生型及突變型質(zhì)粒與miRNA模擬物和miRNA抑制劑共同轉(zhuǎn)染于PDLCs中,negative control與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染做陰性對(duì)照,以GV272為空白對(duì)照。
　　研究結(jié)果:
　　1、通過在線預(yù)測軟件TargetScan;DIANA-microT;

7、miRanda和PITA預(yù)測可能靶向于MMP-23’UTR的 miRNAs,綜合四個(gè)軟件不同的算法預(yù)測出miR-520h;miR-520g;miR-519d-3p;miR-519c-3p;miR-519d五個(gè)miRNAs可能靶向MMP-23’UTR。
　　2、連續(xù)培養(yǎng)的人PDLCs增殖快,細(xì)胞呈集落狀生長,單個(gè)細(xì)胞可見2~4個(gè)細(xì)胞突起;免疫組化法檢測細(xì)胞抗角蛋白陰性,抗波形絲蛋白陽性。
　　3、人牙周膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-

8、miRNAs后可觀察到miRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯上升(P<0.01)。人牙周膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-520h-mimics;miR-520g-mimics;miR-519d-3p-mimics;miR-519c-3p-mimics能明顯抑制MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。但轉(zhuǎn)染miR-519d-mimics后并沒有引起MMP-2mRNA和蛋白表達(dá)的變化(P>0.05)。miR-520h-mimics; miR-5

9、20g-mimics; miR-519d-3p-mimics;miR-519c-3p-mimics分別和野生型MMP-2共轉(zhuǎn)染PDLCs中可引起熒光素酶活性下降(P<0.05),突變型轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無明顯變化。miR-519d-mimics和MMP-2野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞沒有使熒光素酶活性產(chǎn)生變化,與PCR和Western結(jié)果一致(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、通過miRNAs預(yù)測軟件的綜合結(jié)果預(yù)測到5種miRN

10、As:miR-520h、miR-520g、miR-519b-3p、miR-519c-3p、miR-519d可負(fù)性調(diào)控MMP-2的表達(dá)。
　　2、人牙周膜細(xì)胞被miR-mimics組轉(zhuǎn)染后,其miR-520h、miR-520g、miR-519b-3p、miR-519c-3p、miR-519d呈高表達(dá)。
　　3、在牙周膜細(xì)胞中miR-520h;miR-520g;miR-519b-3p;miR-519c-3p顯著下調(diào)MMP-2mR