miR-29家族對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、乳品產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展及人們生活水平的不斷進(jìn)步，使乳制品消費(fèi)市場(chǎng)不斷擴(kuò)大，怎么進(jìn)一步提升乳產(chǎn)量和優(yōu)化乳品質(zhì)已經(jīng)成為了當(dāng)今奶業(yè)研究的重點(diǎn)。微小RNA(miRNA)是一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小RNA分子。在動(dòng)物中，miRNA與其靶基因的3'UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合時(shí)抑制其翻譯或特異性切割靶mRNA使其降解從而調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化中發(fā)揮重要作用，不少研究表明miRNA在哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育和泌乳中具有重要調(diào)控功能。<

2、br>　　表觀遺傳作為目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，已有研究證明它在乳蛋白基因的表達(dá)及動(dòng)物乳腺發(fā)育和重塑的過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。DNA甲基化作為主要的表觀遺傳修飾方式之一，在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下，CpG二核苷酸的胞嘧啶環(huán)5'位的氫被S-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代變成5'-甲基胞嘧啶，通過(guò)這種作用機(jī)制在不改變DNA堿基序列的情況下調(diào)控基因在組織和細(xì)胞中的表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括DNMT1、DNMT

3、3A和DNMT3B，其中DNMT3A和DNMT3B具有從頭甲基化活性，不需要母鏈的指導(dǎo)，可在未甲基化的DNA雙鏈上進(jìn)行甲基化，在基因組DNA甲基化異常的發(fā)生中具有重要的引導(dǎo)作用。DNA甲基化參與許多重要生理及病理現(xiàn)象的調(diào)控，有研究表明在奶牛乳腺中DNA甲基化與乳蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)密切相關(guān)，這就為乳腺發(fā)育、泌乳功能機(jī)理研究提供了新的方向。
　　miRNA對(duì)DNA甲基化模式的調(diào)控多數(shù)集中在腫瘤等疾病的研究上，在奶牛乳腺中還鮮見(jiàn)報(bào)道。本

4、課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA在高、低乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達(dá)具有顯著差異，在高乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中上調(diào)的miRNAs中，miR-29s家族(miR-29a、miR-29b、mir-29c)與在DNA甲基化中起關(guān)鍵作用的DNA甲基化酶DNMT3A和DNMT3B的3'UTR有互補(bǔ)序列，miR-29s是否能通過(guò)調(diào)控制DNA的甲基化進(jìn)而影響奶牛乳腺發(fā)育和泌乳功能就成為了我們研究的重點(diǎn)。
　　本研究以本實(shí)驗(yàn)室原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(D

5、CMECs)為模型，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-29smimics/inhibitor，首先利用雙熒光素酶活性檢測(cè)及綠色熒光蛋白GFP表達(dá)檢測(cè)進(jìn)行了miR-29s靶基因的驗(yàn)證;應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量及Western blotting技術(shù)檢測(cè)DNMT3A/3B及泌乳相關(guān)基因表達(dá)的變化;采用重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)(BSP)分析了泌乳相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化的改變;通過(guò)細(xì)胞中添加甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dc后觀察了泌乳相關(guān)基因及miR-29s

6、表達(dá)的變化;使用CASY細(xì)胞活力分析儀檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力的變化;應(yīng)用EdU標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)了對(duì)細(xì)胞增殖的影響;同時(shí)使用酪蛋白檢測(cè)試劑盒、TG檢測(cè)試劑盒和乳糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了細(xì)胞分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
　　(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與小RNA測(cè)序結(jié)果基本一致，顯示高乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中miR-29s的表達(dá)與低乳品質(zhì)及非泌乳奶牛乳腺組織相比均顯著升高(P＜0.05)。
　　(2)靶基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

7、表明，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，DNMT-3A/-3B是miR-29s的靶基因，miR-29s能通過(guò)負(fù)調(diào)控DNMT3A/3B的表達(dá)降低細(xì)胞基因組DNA總體甲基化水平(GDM)及甲基轉(zhuǎn)移酶的活力。
　　(3)熒光定量PCR及Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-29s能影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中泌乳相關(guān)基因mRNA及蛋白的表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-29s時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的AKT1、mTOR、ELF5、CSN1S1、SREBP1

8、、PPARγ、GLUT1表達(dá)量均顯著下降;抑制內(nèi)源性miR-29s表達(dá)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)AKT1、mTOR、ELF5、CSN1S1、SREBP1、PPARγ、GLUT1的表達(dá)均升高;推測(cè)miR-29s對(duì)乳成分的合成及分泌具有重要的調(diào)控作用。
　　(4)重亞硫酸鹽測(cè)序結(jié)果表明，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中沉默miR-29b時(shí)，Elf5、Csn1s1、Srebp1、PparG、Glut1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平均有明顯的升高，而Akt1及mTOR

9、啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化水平?jīng)]有明顯變化。5-Aza-dc處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，熒光定量PCR檢測(cè)Elf5、Csn1s1、Srebp1、PparG、Glut1、Akt1、mTOR mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)5-Aza-dc處理組與空白對(duì)照組相比Elf5、Csn1s1、Srebp1、PparG、Glut1的mRNA表達(dá)顯著升高，Akt1、mTOR mRNA的表達(dá)無(wú)顯著變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-29s主要通過(guò)調(diào)控DNA甲基化模式影響泌乳重要基因

10、Elf5、Csn1s1、Srebp1、PparG、Glut1的表達(dá)，對(duì)Akt1、mTOR的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。
　　(5)用5-Aza-dc處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，與空白對(duì)照組相比miR-29a、miR-29c的表達(dá)變化并不明顯，miR-29b的表達(dá)顯著升高。重亞硫酸鹽測(cè)序結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，miR-29b啟動(dòng)子區(qū)域甲基化明顯升高。結(jié)果表明在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)受到DNA甲基化水平的調(diào)控。
　

11、　(6)應(yīng)用CASY及EdU標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-29s對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力、細(xì)胞增殖均具有促進(jìn)作用。檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌β-酪蛋白(CSN2)、乳糖及甘油三酯的結(jié)果表明，超量表達(dá)miR-29a、-29b、-29c能促進(jìn)乳蛋白、乳脂及乳糖的合成;沉寂miR-29s對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的分泌均有抑制作用，且5-Aza-dc能恢復(fù)或部分逆轉(zhuǎn)miR-29s抑制子對(duì)乳成分合成的抑制作用，提示miR-29s對(duì)奶牛乳

12、腺泌乳的調(diào)控與DNA甲基化作用密切相關(guān)。
　　綜上，miR-29a、miR-29b、miR-29c為乳腺泌乳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的成員，通過(guò)調(diào)控其靶基因Dnmt3a/3b的表達(dá)影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞DNA甲基化水平。泌乳相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平的改變能引起基因表達(dá)的變化，進(jìn)而影響乳腺細(xì)胞的增殖和乳成分的生成及分泌。miR-29s通過(guò)調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞DNA甲基化參與乳腺泌乳調(diào)控的作用機(jī)制的闡明為今后奶牛業(yè)乳品質(zhì)的優(yōu)化及乳腺泌乳生物