Tamoxifen通過下調(diào)miR-200家族表達促進子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究.pdf

1、TAMOXIFEN（他莫昔芬，TAM）作為雌激素競爭拮抗劑能夠與乳腺細(xì)胞的雌激素受體結(jié)合，對依賴雌激素生長的乳腺癌細(xì)胞起到抑制的作用，它已經(jīng)被應(yīng)用治療雌激素受體陽性的乳腺癌患者。但是研究表明，TAM在子宮組織中可以表現(xiàn)出擬雌激素的作用，從而誘發(fā)組織中腫瘤的發(fā)生。例如，雌激素是誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌的一個關(guān)鍵因素，雖然TAM擬雌激素的作用對于絕經(jīng)期的婦女可以有效的維持骨量，但是卻能夠提高子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率，誘發(fā)子宮內(nèi)膜發(fā)生增生、息肉、癌、肉瘤等多

2、種病理改變。
　　MicroRNA(miRNA)是由約22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，它們能夠在轉(zhuǎn)錄后水平通過與靶mRNA3'非編碼翻譯區(qū)堿基形成特異性互補配對，抑制靶基因的翻譯或降低mRNA的穩(wěn)定性，從而沉默或干擾靶基因的表達。近些年來miRNA被發(fā)現(xiàn)在胚胎的發(fā)生和腫瘤調(diào)控等復(fù)雜的生理過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　miR-200在調(diào)控上皮間質(zhì)變(EMT)過程發(fā)揮了重要的作用，影響腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。miR-200家族能夠

3、通過直接抑制靶基因ZEB1和ZEB2來上調(diào)E-cadherin的表達，從而抑制了EMT的發(fā)生。在本研究中，我們探索了miR-200這個EMT過程中發(fā)揮重要作用的miRNA分子在TAM作用的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的作用及其相關(guān)調(diào)控機制。
　　首先，我們發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系ECC-1在TAM的作用下發(fā)生了EMT的轉(zhuǎn)化。ECC-1細(xì)胞是一類雌激素依賴的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系。我們通過實時定量的方法驗證，ECC-1在TAM的刺激下，EMT相關(guān)的標(biāo)記

4、分子的mRNA水平發(fā)生了明顯的變化，出現(xiàn)了向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢。劃痕試驗和細(xì)胞侵襲試驗也驗證細(xì)胞在TAM的作用下，細(xì)胞的遷移和侵襲能力有明顯的增強。
　　為探索miRNAs在TAM誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中的作用，我們用miRNAs表達譜芯片檢測了TAM刺激ECC-1細(xì)胞前后有明顯差異的miRNAs。發(fā)現(xiàn)了4種miRNAs顯著的上調(diào)，19種miRNAs顯著的下調(diào)。其中miR-200b分子已被證實在乳腺癌等腫瘤中能夠促進EM

5、T，并在這些腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用。為闡明TAM誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞發(fā)生EMT的分子機制，我們把miR-200分子作為后續(xù)實驗的研究對象，深入研究了miR-200與ECC1發(fā)生EMT的關(guān)系及miR-200自身的調(diào)控機制。
　　根據(jù)生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測ZEB2為miR-200家族的靶基因，我們通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-200b能夠結(jié)合ZEB2的3'UTR。在ECC-1細(xì)胞中過表達miR-200

6、b能夠上調(diào)E-cadherin和下調(diào)Snail和N-cadherin等EMT重要基因的表達。miR-200b能夠明顯抑制TAM刺激的ECC-1細(xì)胞的侵襲能力。
　　我們接下來闡明了TAM刺激ECC-1細(xì)胞調(diào)控miR-200b-200a-429啟動子的相關(guān)機制。首先我們克隆出miR-200b-200a-429啟動子的熒光素報告載體，利用生物信息學(xué)軟件TESS對miR-200b-200a-429的啟動子序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)了啟動子區(qū)域

7、有c-Myc,c-Myb,sp1等重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。我們進一步用實驗表明c-Myc能夠特異性的結(jié)合miR-200b-200a-429的啟動子并對其活性有明顯的抑制作用。而且我們發(fā)現(xiàn)TAM能夠上調(diào)ECC-1細(xì)胞中c-Myc的表達。
　　綜上所述，我們確定了miR-200家族作為一個重要的因子在TAM誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌變中可能發(fā)揮了重要的作用。TAM通過上調(diào)c-Myc來抑制miR-200的表達，miR-200表達的下降導(dǎo)致靶基因ZE