miR-874調控MMp-2表達在椎間盤退變中的作用機制研究.pdf

1、人椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)是脊柱退行性病變發(fā)生的病理基礎。據統計，由IVDD所導致的頸椎功能障礙性疾病在我國的發(fā)病率高達6％-10％，且發(fā)病年齡呈年輕化的趨勢。IVDD的遠期預后很差，其晚期的高致殘率也越來越被醫(yī)學界重視。該病不僅給患者帶來嚴重痛苦，而且對患者家庭乃至社會都帶來沉重的經濟負擔。因此有效地治療IVDD、預防殘疾的發(fā)生是關系國計民生的重大科學問題。
　　目

2、前對于椎間盤退變的具體機制仍不甚了解。許多研究發(fā)現髓核細胞凋亡及細胞外基質過度降解是椎間盤退變的主要病理改變，而MMPs在髓核細胞凋亡及細胞外基質過度降解引起的間盤退變過程中，扮演了關鍵角色。最新的研究表明，IVDD還受到microRNA介導的轉錄后調控機制影響。microRNA是一種長約19-22bp的小雙鏈RNA，其家族是體內天然存在的一種內源性調節(jié)性分子。其在體內可以通過嚴格或不嚴格匹配機制，調節(jié)靶基因mRNA的翻譯及其降解，可系

3、統性改變一系列基因的表達，并進一步影響細胞表型的變化。microRNA本身在體內也可以接受各種轉錄因子及信號轉導通路的調控。最近，有研究發(fā)現mir-21在IVDD中會顯著上調，通過轉錄后抑制PTEN的表達，促進髓核的異常分化，從而在IVDD中發(fā)揮作用。最新的研究還發(fā)現人IVDD中miR-155出現表達顯著下調，其能特異性靶向凋亡相關分子FADD、caspase-3的3'UTR區(qū)，過表達mir-155可導致FADD、caspase-3的表

4、達下調，從而抑制髓核細胞的凋亡。上述研究可見microRNA的表達改變在IVDD發(fā)生發(fā)展中可能具有重要意義。因此，本課題組設想，可能存在一條miRNA/MMPs通路，通過轉錄后調控來影響髓核細胞凋亡及細胞外基質過度降解，進一步導致CIDD的發(fā)生發(fā)展。
　　目的：
　　本課題通過前期研究發(fā)現了miR-874在IVDD中出現表達異常，隨著退變程度的加重表達逐漸下調，而分解代謝及髓核細胞凋亡相關分子MMP-2、MMP-3隨著退變程

5、度的加重表達逐漸上調，與miR-874的表達存在負相關，提示二者可能存在潛在的相互關系，在IVDD中共同發(fā)揮重要的作用。但是，上述調控因素之間如何相互協作，目前的認識還很不充分，也是當前研究的前沿問題。如果發(fā)現這些調控因素間新的相互作用機制和模式，無疑大大有利于加深對IVDD發(fā)生發(fā)展機制的認識，并有助于推動IVDD分子治療的進展，具有重要的科學及社會意義。
　　針對上述問題，本課題提出一種新的頸椎間盤退變調控機制:microRNA

6、miR-874通過直接結合MMP-2的3'UTR區(qū)調控其表達豐度，抑制髓核細胞外基質主要成分即Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的表達，從而促進人髓核細胞凋亡及細胞外基質的過度降解。通過多種實驗方法揭示microRNA的轉錄后調控協調參與到人IVDD調控網絡中的方式和機制，找出可干預的新靶點，為最終有效地防治IVDD并發(fā)的殘疾提供科技支撐。
　　方法：
　　1.明確miR-874與人IVDD相關，收集不同退變程度椎間盤髓核組織樣本，抽提

7、RNA，經過反轉錄后，qRT-PCR檢測miR-874在髓核中表達水平與疾病嚴重程度的相關性。
　　2.實驗證實miR-874與MMP-2表達量相關，在不同miR-874表達水平的人髓核樣本中，利用qRT-RCR、Western-blot及免疫組化檢測MMP-2表達量，分析miR-874與MMP-2表達量的相關性。
　　3.利用miRNA靶向預測軟件RNA22進行miR-874靶基因生物信息學分析，在髓核細胞中轉染miR-8

8、74模擬物(miR-874 mimics)，qRT-PCR以及Northern-blot檢測MMP2的表達水平;構建MMP2熒光素酶報告基因，驗證miR-874是否可以靶向調節(jié)MMP2。
　　4.體外實驗研究miR-874對IVDD相關表型的影響，分離培養(yǎng)人髓核細胞，構建miR-874過表達以及干擾慢病毒，在髓核細胞中分別感染上述慢病毒，在過表達及干擾/敲除miR-874后分別檢測如下指標:Annexin V-APC單染法流式細胞

9、儀檢測細胞凋亡、MTT髓核細胞增殖檢測實驗。
　　5.研究miR-874對人髓核細胞外基質的影響，培養(yǎng)人髓核細胞，感染上述慢病毒，在過表達及干擾/敲除miR-874后，利用qRT-RCR以及Western-blot檢測MMP-2表達量，并檢測Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等ECM主要成分的表達情況。
　　6.體內實驗驗證miR-874干預對IVDD的作用及機制，通過超聲引導下兔椎間盤纖維環(huán)刺破方法，以18G針頭刺破纖維環(huán)，進針深度0.5

10、cm，抽吸部分髓核組織建立兔椎間盤退變模型。造模成功后，分別與超聲引導下在模型兔的椎間盤中注射miR-874Agomirs及miR-874 mimics，在時間點4周、8周、12周分別進行X線、MRI檢測進行影像學評估，12周后處死IVDD模型動物，獲取椎間盤組織行病理學檢測，評價miR-874對IVDD的影響。
　　結果：
　　1.miR-874在退變較重組髓核組織中下調了0.7倍，同時MMP-2 mRNA及蛋白水平表達上

11、調，與riR-874的表達存在負相關，而ACAN mRNA及蛋白水平表達下調。免疫組化發(fā)現隨著退變的加重，髓核組織中ACAN及Ⅱ型膠原表達下調。
　　2.構建包含2個miR-874結合位點的MMP23'UTR區(qū)報告基因質粒與mir-874共轉染，檢測發(fā)現熒光素酶活性抑制，證實二者靶向關系。
　　3.體外實驗研究，在髓核細胞中分別感染miR-874過表達以及干擾慢病毒后，MTT檢測發(fā)現髓核細胞增殖在干擾時非常緩慢，而過表達后增

12、殖明顯加快，二者有顯著差異。流式細胞儀檢測結果顯示干擾時凋亡數增加，而過表達后凋亡數顯著減少，二者有顯著差異。
　　4.體外實驗研究，在髓核細胞中分別感染miR-874過表達以及干擾慢病毒后，發(fā)現過表達miR-874導致MMP-2下調，同時抑制Aggrecan和CollagenⅡ降解，且發(fā)生COL2A1增加和COL1A1減少，提示細胞外基質合成增多。而下調miR-874導致相反結果。
　　5.體內實驗研究，在模型兔的椎間盤中

13、注射miR-874 Agomirs及miR-874mimics后，發(fā)現過表達miR-874可減緩兔椎間盤退變的進程，X線及MRI均發(fā)現過表達組椎間盤退變程度較下調組降低，且MMP-2表達降低，Aggrecan表達增高，提示細胞外基質合成增多，miR-874為椎間盤退變中的保護因子。
　　結論：
　　1.通過本課題研究證實了miR-874通過調控細胞外基質分解代謝相關分子MMP-2表達，從而抑制Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等ECM主要成