不同方法脫豬主動(dòng)脈瓣膜細(xì)胞的對比研究.pdf

1、心臟瓣膜置換術(shù)作為一種治療終術(shù)期心臟瓣膜疾病的有效手段廣泛應(yīng)用于臨床，人工心臟瓣膜伴隨這一術(shù)式的開展也經(jīng)歷了50多年的發(fā)展。隨著人工瓣膜質(zhì)量的不斷完善，廣大瓣膜病患者的生存質(zhì)量和壽命得到了極大的改善，但目前臨床上所采用的兩大類人心臟工瓣膜——機(jī)械瓣和生物瓣都存在一定缺陷：機(jī)械瓣植入后需終生抗凝防止血栓栓塞并發(fā)癥的發(fā)生；異種生物瓣耐久性差，易發(fā)生鈣化、衰敗，而低溫保存的同種瓣膜存在排斥反應(yīng)，且供體來源困難。并且，現(xiàn)有的人造心臟瓣膜都不具有

2、生物活性，移植后不能隨著機(jī)體生長，對于低年齡瓣膜病患者尤其不利。因此，構(gòu)建一種理想的人工心臟瓣膜成為心臟瓣膜外科研究的重點(diǎn)。 上世紀(jì)九十年代創(chuàng)立的組織工程學(xué)(Tissue Engineering，TE)為人工心臟瓣膜的研究提供了全新的思路和方法，應(yīng)用組織工程原理構(gòu)建人工心臟瓣膜成為心臟瓣膜研究新的方向。組織工程心臟瓣膜(Tissue Engineering Heart valve，TEHV)的基本思路是：將體外培養(yǎng)的自體高濃度功

3、能相關(guān)的活細(xì)胞種植于天然的或人工合成的可降解支架材料上，并使其牢固黏附、生長，從而構(gòu)建具有正常瓣膜組織新陳代謝功能的人工心臟瓣膜。跟現(xiàn)有的人工心臟瓣膜比較，組織工程心臟瓣膜具有以下優(yōu)勢：1．組織工程心臟瓣膜的結(jié)構(gòu)與正常心臟瓣膜基本相同，相對于機(jī)械瓣有著更好的血流動(dòng)力學(xué)特性。2．組織工程心臟瓣膜內(nèi)部及表面的細(xì)胞成分與正常瓣膜相同且為自體細(xì)胞，無免疫原性，無需抗凝。3．組織工程心臟瓣膜有生物活性，能隨機(jī)體生長發(fā)育，不易退化、衰敗，耐久性強(qiáng)，

4、可有效避免二次手術(shù)。理論上，組織工程心臟瓣膜完全克服了目前臨床所用的兩類人工心臟瓣膜的缺點(diǎn)，具有很好的臨床應(yīng)用前景。組織工程心臟瓣膜的研究大體包括：種子細(xì)胞的來源、瓣膜支架的選材和制備、種子細(xì)胞在支架上的種植與TEHV的構(gòu)建三個(gè)方面的內(nèi)容。瓣膜支架是組織工程心臟瓣膜的基礎(chǔ)，它是細(xì)胞黏附的支持臺并決定瓣膜的基本構(gòu)形和工作方式。支架不僅要提供種子細(xì)胞生長的空間和瓣膜組織細(xì)胞生成的模板，要求在瓣膜自身細(xì)胞基質(zhì)生成之前提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度，承受快

5、速血流的沖擊所產(chǎn)生的張力和剪切力，而且決定著移植后與機(jī)體適應(yīng)、結(jié)合、修復(fù)和替代的效果?？梢哉f，支架的材料選擇和制備是限制組織工程心臟瓣膜能否真正應(yīng)用于臨床的一個(gè)關(guān)鍵因素。 異種脫細(xì)胞基質(zhì)材料具有正常瓣膜相似的空間結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，而且經(jīng)過去細(xì)胞處理后消除了免疫原性，被認(rèn)為是一類很有臨床應(yīng)用前景的瓣膜支架材料。本實(shí)驗(yàn)研究去垢劑法、酶水化法等不同脫細(xì)胞方法對豬主動(dòng)脈瓣膜組織及生物力學(xué)性能的影響，探討脫細(xì)胞基質(zhì)瓣膜支架制備的最佳方法。

6、 方法 第一部分：豬主動(dòng)脈瓣葉脫細(xì)胞支架模型的建立。1．健康成年豬宰殺后15分鐘內(nèi)取出主動(dòng)脈瓣膜及少量瓣上組織，75％乙醇消毒后無菌條件下剪下瓣葉。2．將上述瓣葉隨機(jī)分為5組，分別采用曲拉通(TrixionX-100)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸(DCA)、胰蛋白酶、核酸酶等的其中一種或幾種試劑進(jìn)行脫細(xì)胞處理。3．經(jīng)過脫細(xì)胞處理的瓣葉放入瓣葉保存液中4℃保存。 第二部分：脫細(xì)胞效果評價(jià)。1．光鏡、掃描電鏡下觀

7、察上述各組脫細(xì)胞瓣葉脫細(xì)胞效果及脫細(xì)胞基質(zhì)纖維排列情況；2．測試各組脫細(xì)胞瓣葉的厚度、含水量、熱皺縮溫度，與新鮮瓣葉組對照觀察不同方法脫細(xì)胞對瓣葉物理性能的影響。3．DNA定量分析各組脫細(xì)胞瓣葉的細(xì)胞核酸成分殘留情況。 結(jié)果 (1)胰酶及去污劑法處理的脫細(xì)胞基質(zhì)對瓣葉的理化性能無明顯影響。 (2)胰酶+曲拉通+EDTA+核酸酶法及胰酶+DCA+EDTA+核酸酶法均可完全去除豬主動(dòng)脈瓣葉的細(xì)胞成分。 (3)