腹腔預處理去細胞光氧化豬主動脈瓣膜制備組織工程瓣膜.pdf

1、第一部分去細胞結(jié)合光氧化對豬主動脈瓣膜組織學和生物力學的影響。
　　 目的：采用去細胞結(jié)合染料介導的光氧化法處理豬主動脈瓣膜，尋找合適去細胞方案；評價光氧化交聯(lián)法對豬主動脈瓣膜的生物力學性能的影響。
　　 方法：
　　 體外性能的研究：將120個瓣膜隨機分為12組，每組10個，通過對瓣膜多步驟的去細胞效果，以及膠原彈力纖維保存的完整性等方面評價，獲得去細胞的合適方案；將修剪好的40去細胞豬主動脈瓣膜隨機分為4組，

2、每組10個。F組：為新鮮組，置于無菌PBS液中40℃保存?zhèn)溆谩P組：為去細胞結(jié)合光氧化處理組，共計三個亞組：DP12h組：為去細胞處理后再進行染料介導的光氧化處理12小時；DP24h組：去細胞后光氧化反應24小時；DP36h組：去細胞后光氧化反應36小時。通過熱皺縮溫度、組織含水量、最大抗張強度和最大拉伸距離及體外酶降解實驗評價光氧化的最理想時間。
　　 體內(nèi)性能研究：得到合適去細胞光氧化方案后，將45個瓣膜分為3組，新鮮組、

3、戊二醛組、去細胞光氧化組。通過熱皺縮溫度、塌大抗張強度和最大拉伸距離評價各瓣膜性能。然后建立大鼠皮下包埋模型，12周后獲取組織標本，通過HE染色，比較各組瓣葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及炎性反應情況；原子吸收光譜法測定組織鈣含量，評價光氧化處理對去細胞豬主動脈瓣膜的體內(nèi)生物穩(wěn)定性及抗鈣化性能影響。
　　 結(jié)果：
　　 采用多步驟去垢劑-酶消化法處理豬主動脈瓣膜，能夠有效的去除瓣膜的細胞成分同時保留了完整的細胞外基質(zhì)成分。第Ⅷ組脫細胞

4、處理后的豬瓣膜比較理想，組織大體形態(tài)和新鮮豬瓣膜相似，光鏡觀察結(jié)果顯示：細胞成分去除徹底，未見明顯細胞殘留成分，膠原彈力纖維保存較完整，組織結(jié)構(gòu)無明顯疏松。
　　 光鏡結(jié)果顯示，經(jīng)光氧化反應進一步交聯(lián)后去細胞瓣膜的組織結(jié)構(gòu)將變緊湊，24小時可達最佳效果。機械性能檢測顯示，光氧化交聯(lián)去細胞后的瓣膜，其機械性能將逐漸恢復，至光氧化24小時后去細胞豬主動脈瓣膜的機械性能與新鮮組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；體外抗酶降解實驗結(jié)果表明

5、，去細胞光氧化后的豬主動脈瓣膜抗酶解能力相比新鮮的豬主動脈瓣膜有所提高，光氧化處理24小時后的抗酶解能力要優(yōu)于12小時，與再處理12小時的效果無明顯差異(P>0.05)。
　　 體內(nèi)性能研究結(jié)果顯示，大鼠皮下包埋實驗中，新鮮對照組的豬主動脈瓣膜發(fā)生了比較嚴重、廣泛的炎性反應，并出現(xiàn)了一定程度的溶解；去細胞光氧化組的炎性反應是所有組別中最輕的。鈣含量測定結(jié)果顯示去細胞光氧化組鈣化程度最低，與其它兩組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；去

6、細胞光氧化組的生物穩(wěn)定性要優(yōu)于新鮮的豬主動脈瓣膜及戊二醛組，瓣葉無明顯降解，炎性細胞浸潤少且范圍局限，組織結(jié)構(gòu)保存較好并有新生血管形成。戊二醛處理組可見明顯大片團聚鈣化區(qū)域，鈣含量測定結(jié)果與其它兩組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用多步驟去垢劑一酶消化法(0.25％曲那通X-10024h，0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA10min，30u/mlDNase-I和0.3mg/mlRNase

7、-A12h)是適合豬主動脈瓣膜的較佳脫細胞方案，能夠有效去除其細胞成分，同時完整保存膠原纖維及彈力纖維。
　　 2.光氧化反應對去細胞豬主動脈瓣膜的交聯(lián)作用呈時間依賴性，至光氧化反應24小時性能表現(xiàn)最佳。
　　 3.相比新鮮豬主動脈瓣膜，去細胞光氧化反應交聯(lián)的豬主動脈瓣膜脈免疫原性低，生物耐受程度好。而相對戊二醛處理的豬主動脈瓣膜則具有更好的抗鈣化性能。
　　 4.去細胞結(jié)合光氧化處理有可能成為前景廣泛、適合于處

8、理豬主動脈瓣膜新型處理方法。
　　 第二部分腹腔預處理制備組織工程瓣膜。
　　 目的：評價腹腔預處理的去細胞光氧化的豬主動脈瓣膜在體內(nèi)生物學性能及抗栓性能，細胞生長情況。
　　 方法：
　　 成年狗10只，雌雄不拘，隨機分為兩組，一組為腹腔預處理組，一組為普通組。去細胞光氧化的豬主動脈瓣膜，植入狗的腹腔內(nèi)5天，然后取出裁剪成帶瓣血管片，吻合到同一只狗的腹主動脈上，2月后取出，普通組是將去細胞光氧化的豬主動

9、脈瓣膜裁剪成帶瓣血管片直接吻合到狗的腹主動脈上，2月后取出。觀察其細胞生成情況，Ⅷ因子染色和α-SMA免疫組化染色觀察其內(nèi)皮細胞和肌成纖維細胞的生長情況，通過熱皺縮溫度、最大抗張強度和最大拉伸距離評價其機械性能。
　　 結(jié)果：
　　 兩組狗術(shù)后均無死亡，大體觀察兩組帶瓣血管片光滑，無血栓形成。
　　 Ⅷ因子染色和α-SMA染色顯示預處理組的帶瓣血管片上有大量的肌成纖維細胞生成，表面有單層排列的內(nèi)皮細胞，普通組有少

10、量的肌成纖維細胞和散在的內(nèi)皮細胞生成。機械性能研究顯示腹腔預處理組的帶瓣血管片熱皺縮溫度、最大抗張強度和最大拉伸距離明顯強于普通組的帶瓣血管片p<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 去細胞結(jié)合光氧化反應處理的豬主動脈瓣膜植入體內(nèi)后無不良反應，生物穩(wěn)定性好，無血栓形成
　　 腹腔預處理制備的組織工程瓣膜體內(nèi)能夠再細胞化，其機械性能保持好，抗栓性能好。
　　 腹腔預處理方法有望成為構(gòu)建組織工程瓣膜的新途徑。