原花青素交聯(lián)去細(xì)胞豬主動脈瓣——改進(jìn)生物瓣處理方法的實(shí)驗研究.pdf

1、瓣膜置換術(shù)是治療各種心臟瓣膜疾病的唯一有效手段。目前臨床應(yīng)用的人工瓣膜主要是機(jī)械瓣和生物瓣，其中生物瓣的應(yīng)用越來越廣泛，在西方國家有的已超過機(jī)械瓣的用量。主要原因是機(jī)械瓣的終生抗凝治療及其抗凝并發(fā)癥導(dǎo)致的遠(yuǎn)期效果與生物瓣沒有明顯差別。而生物瓣只需術(shù)后短期抗凝治療，且有較好的仿生血流動力學(xué)特點(diǎn)，術(shù)后并發(fā)癥較少。但是生物瓣鈣化、耐久性差的問題是不容忽視的。目前認(rèn)為，生物瓣鈣化可能與瓣膜基質(zhì)的丟失及戊二醛的作用，機(jī)械應(yīng)力造成生物瓣損傷，宿主鈣

2、磷代謝影響，炎癥和免疫反應(yīng)等因素有關(guān)。針對這一問題，國內(nèi)外眾多實(shí)驗室都在尋求解決的方法，但結(jié)果均不理想。而在組織工程瓣膜的研究中，對生物原性的瓣膜材料進(jìn)行去細(xì)胞處理后所獲得的去細(xì)胞瓣膜支架材料，由于去除了細(xì)胞成分，完整保存細(xì)胞外基質(zhì)，具有較低的免疫原性和鈣化潛能，為瓣膜的抗鈣化處理指出了一條新的徑路。但去細(xì)胞處理后的瓣膜尚需進(jìn)一步處理，以增強(qiáng)其力學(xué)強(qiáng)度和耐久性能。本研究擬選取經(jīng)去細(xì)胞處理的豬主動脈瓣膜為基礎(chǔ)材料，應(yīng)用一種新型的生物源性交

3、聯(lián)劑-----原青花素交聯(lián)處理，構(gòu)建新型去細(xì)胞生物瓣，并通過體外、體內(nèi)試驗，檢測原青花素處理去細(xì)胞瓣膜的生物學(xué)、理化、抗鈣化性能及組織、細(xì)胞相容性，為改進(jìn)生物瓣交聯(lián)處理方法做新的探索。
　　第一部分：原花青素交聯(lián)處理去細(xì)胞豬主動脈瓣膜的構(gòu)建及生物物理性能評價。取回新鮮豬主動脈瓣膜，按本實(shí)驗室建立方法經(jīng)去細(xì)胞處理后，檢測其去細(xì)胞效果，進(jìn)而經(jīng)0.1％原花青素交聯(lián)處理后，檢測原花青素去細(xì)胞瓣膜的厚度、組織含水量、熱皺縮溫度、可溶性蛋白含

4、量、斷裂強(qiáng)度、耐久性、抗酶解性能、交聯(lián)度等生物生物物理性能，并與新鮮未去細(xì)胞瓣膜、去細(xì)胞瓣膜、戊二醛交聯(lián)去細(xì)胞瓣膜比較。結(jié)果顯示：去細(xì)胞效果滿意，細(xì)胞成分去除徹底，纖維支架保存完整；原花青素去細(xì)胞瓣膜組厚度（0.15±0.04）mm、含水量（89.1±3.4）％、熱皺縮溫度（71±4.1）℃，與未去細(xì)胞組（0.16±0.07）mm、（88.7±4.7）％、（74±2.9）℃，單純?nèi)ゼ?xì)胞組（0.18±0.11）mm、（90.3±4.3）％

5、、（73.3±5.1）℃均無明顯差別（p>0.05），而與戊二醛處理組（0.27±0.08）mm、（75.1±3.9）％、（87.4±4.3）℃差別顯著（p<0.05）；而原花青素去細(xì)胞瓣膜組可溶性蛋白含量（0.71±0.22）％，與未去細(xì)胞組（2.16±0.32）％、單純?nèi)ゼ?xì)胞組（1.47±0.27）％均差別顯著（p<0.05），而與戊二醛處理組（0.76±0.16）％無明顯差別（p>0.05）；原花青素去細(xì)胞瓣膜組斷裂強(qiáng)度（11.8

6、±0.91）mPa較其余各組（8.71±1.12）mPa、（8.25±1.07）mPa、（9.15±0.97）mPa均明顯增強(qiáng)；耐久性實(shí)驗發(fā)現(xiàn)原花青素處理組在PBS保存45天后斷裂強(qiáng)度無明顯變化；24h抗酶解實(shí)驗可見新鮮瓣膜組及去細(xì)胞瓣膜組至2h已幾乎全部降解，失重率接近100％，而降解24h后，原花青素去細(xì)胞瓣膜組和戊二醛處理組失重率分別為（10.21±1.8）％、（7.17±1.1）％，兩組間亦未見明顯差異。由上可知，原花青素處理去

7、細(xì)胞瓣膜，在去除細(xì)胞成分及鈣結(jié)晶核、降低免疫原性的同時，保持了完整的瓣膜構(gòu)型和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，具有較好的力學(xué)性能和生物學(xué)特性。
　　第二部分：原花青素交聯(lián)處理去細(xì)胞豬主動脈瓣膜生物相容性評價。進(jìn)行原花青素去細(xì)胞瓣膜原花青素釋放試驗，并通過L929細(xì)胞直接、間接接觸細(xì)胞毒性實(shí)驗考察原花青素生物相容性。結(jié)果提示：處理后1d原花青素釋放到達(dá)高峰，濃度為798.32±52.31ug/ml，至4d后原花青素釋放濃度下降至7.31±1.12ug/m

8、l，爾后再無明顯釋放；間接接觸細(xì)胞毒性實(shí)驗提示不同時相的細(xì)胞毒性分級均為0－1級；直接接觸細(xì)胞毒性實(shí)驗中光鏡及掃描電鏡結(jié)果可見L929細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)良好，隨時間延長，細(xì)胞數(shù)量增加，在各觀察點(diǎn)，實(shí)驗組和空白對照組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量均無明顯差別。由上可知，原花青素處理去細(xì)胞豬主動脈瓣細(xì)胞毒性低，生物相容性好，成纖維細(xì)胞能夠在其表面良好生長。
　　第三部分：原花青素交聯(lián)處理去細(xì)胞豬主動脈瓣膜抗鈣化性能評價。通過大鼠皮下包埋實(shí)驗，在1、2

9、、3、4、6、8、10、12周提取標(biāo)本，進(jìn)行大體觀察、組織切片HE染色、Masson染色觀察組織相容性，并行Von-Kossa染色、掃描電鏡-能譜分析檢測各組材料抗鈣化性能。結(jié)果提示包埋2w后組織炎癥反應(yīng)輕微，材料保存完好；Von－Kossa染色提示包埋21d單純?nèi)ゼ?xì)胞組可見輕度鈣化，戊二醛處理組出現(xiàn)明顯鈣化，原花青素處理組未見鈣鹽沉積；包埋63d，單純?nèi)ゼ?xì)胞組鈣化程度明顯加重，戊二醛處理組鈣化明顯，原花青素處理組仍未見明顯鈣鹽沉積；掃

10、描電鏡-能譜分析結(jié)果顯示：包埋21d，單純?nèi)ゼ?xì)胞組未見鈣峰出現(xiàn)，戊二醛處理組出現(xiàn)明顯鈣峰，原花青素處理組未見鈣峰出現(xiàn)；包埋63d，單純?nèi)ゼ?xì)胞組出現(xiàn)少量鈣峰，戊二醛處理組鈣峰較前進(jìn)一步增多、增高，原花青素處理組仍未見明顯鈣峰出現(xiàn)。由上提示，原花青素處理去細(xì)胞瓣具有良好的組織相容性和抗鈣化性能。
　　第四部分：原花青素交聯(lián)處理去細(xì)胞豬主動脈瓣膜人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植實(shí)驗。經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，選取3-5代2×10

11、6cm-2種植于原花青素去細(xì)胞瓣膜，觀察人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在原花青素去細(xì)胞豬主動脈瓣的生長情況。結(jié)果提示：所獲得的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，所培養(yǎng)的細(xì)胞不表達(dá)CD34，高表達(dá)CD44，CD44陽性率在(92.12±2.34)％，與平行對照組(3.57±1.16)％比較有顯著性差異(P<0.01)。免疫組化鑒定，MSCs具有特征性的表面標(biāo)志，不表達(dá)CD34，而CD44表達(dá)強(qiáng)陽性。種植細(xì)胞后HE染色光鏡觀察，種植3天瓣膜表面單層細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞具

12、有活性。種植7天，可見瓣膜表面覆蓋細(xì)胞層明顯增厚，多層細(xì)胞生長，具有活性，并有細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞未有向瓣膜深層生長趨勢，瓣膜基質(zhì)完整。掃描電鏡觀察可見，種植7天，瓣膜表面細(xì)胞均勻覆蓋。種植14天后，瓣膜表面覆蓋細(xì)胞層明顯增厚，多層細(xì)胞生長。由上可知，原花青素瓣膜能夠提供細(xì)胞生長的微環(huán)境，而且細(xì)胞能夠發(fā)揮正常的生理功能。說明原花青素瓣膜具有良好的細(xì)胞相容性，且具有能夠在體外快速內(nèi)皮化的特性。
　　通過以上實(shí)驗，初步揭示了原花