氫生理鹽水對(duì)豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、對(duì)于原發(fā)性肝癌及肝轉(zhuǎn)移瘤患者來說，肝切除術(shù)是經(jīng)典且有效的治療手段，可以顯著改善患者的預(yù)后，但同時(shí)也為患者帶來了圍手術(shù)期風(fēng)險(xiǎn)。相對(duì)于局部肝切除術(shù)而言，行擴(kuò)大肝切除術(shù)的患者術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率均較高，而有慢性肝病的患者手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)更高。但是，隨著對(duì)肝臟解剖認(rèn)識(shí)的不斷加深、外科技術(shù)的進(jìn)步和圍手術(shù)期監(jiān)護(hù)水平的提高，擴(kuò)大肝切除的手術(shù)指征在拓展，并且也取得了一定的效果。盡管如此，行擴(kuò)大肝切除術(shù)后仍不可避免的會(huì)出現(xiàn)一些嚴(yán)重的并發(fā)癥，肝功能衰竭就是其

2、中之一，其死亡率高達(dá)70-80％。擴(kuò)大肝切除術(shù)對(duì)肝功能的損傷包括了物理損失和缺血再灌注損傷，如何對(duì)接受擴(kuò)大肝切除術(shù)的患者進(jìn)行有效的肝功能保護(hù)是臨床上比較重視和關(guān)心的問題。針對(duì)缺血再灌注損傷機(jī)制，目前研究證實(shí)有保護(hù)作用的藥物主要分為:自由基清除劑、鈣離子拮抗劑、炎性細(xì)胞因子抑制劑、微循環(huán)改善藥物等。近年來，氫氣抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用逐漸被廣大學(xué)者所重視，大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，氫氣可以通過對(duì)抗氧自由基，減輕ROS系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的損傷，減少細(xì)胞

3、凋亡，從而有效地保護(hù)細(xì)胞，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用。本課題中，我們將首先建立豬70％擴(kuò)大肝切除模型，并評(píng)價(jià)其安全性及臨床模擬性;然后將在確認(rèn)氫生理鹽水對(duì)豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝臟功能的保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，通過測(cè)定幾種炎性細(xì)胞因子水平、幾種凋亡相關(guān)蛋白活性及轉(zhuǎn)錄因子水平等，以進(jìn)一步探討氫生理鹽水在對(duì)豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝功能的保護(hù)作用方面亞細(xì)胞水平及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)制。
　　 一、豬70％擴(kuò)大肝切除模型的建立
　　 目的:建立豬

4、70％擴(kuò)大肝切除模型，并評(píng)估其安全性及臨床模擬性。
　　 材料和方法:6只巴馬小型豬，體重在25-30kg，在全麻條件下行70％肝臟切除術(shù)，術(shù)中給予全肝門阻斷。監(jiān)測(cè)術(shù)中生命體征情況，記錄術(shù)后7天存活率，檢測(cè)術(shù)前及術(shù)后第1、2、3、5、7天的肝功能(TBIL、ALT、AST)及血紅蛋白(HGB)變化。
　　 結(jié)果:術(shù)中生命體征平穩(wěn)，術(shù)后7天存活率100％，無嚴(yán)重并發(fā)癥。術(shù)后TBIL顯著升高(P＜0.05)，術(shù)后第3天到達(dá)峰

5、值，之后逐步恢復(fù)。ALT，AST在術(shù)后5日內(nèi)升高顯著(P＜0.05)，術(shù)后第1日達(dá)到峰值，之后逐步恢復(fù)。監(jiān)測(cè)血常規(guī)HGB未見明顯貧血改變。
　　 結(jié)論:豬70％擴(kuò)大肝切除模型安全穩(wěn)定，具有較好的臨床模擬性，可用于擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝損傷的研究。
　　 二、氫生理鹽水對(duì)豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究。
　　 目的:研究氫生理鹽水對(duì)豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝功能的保護(hù)作用，并從抗氧化、抗炎、抗凋亡及肝再生等方面探討其

6、相關(guān)機(jī)制。
　　 材料和方法:12只巴馬小型豬，體重在25-30kg，隨機(jī)分為70％肝切除+生理鹽水對(duì)照組（NS組，n=6）和70％肝切除+氫生理鹽水實(shí)驗(yàn)組（H2組，n=6），均在全麻條件下行70％肝臟切除術(shù)。氫生理鹽水干預(yù)方案:行擴(kuò)大肝切除術(shù)，并給予全肝門阻斷。解除肝門阻斷后即經(jīng)胃網(wǎng)膜右靜脈置管，給予氫生理鹽水250ml靜滴，之后術(shù)后第1、2、3d均經(jīng)胃網(wǎng)膜右靜脈給予氫生理鹽水250ml。NS組以等量生理鹽水作為對(duì)照。觀察兩組

7、的7d生存率，術(shù)前及術(shù)后第1、2、3、5、7天的肝功能(TBIL、ALT，AST)及血常規(guī)(WBC、HGB)變化。術(shù)后第7d處死動(dòng)物，觀察其肝臟病理改變（光鏡及電鏡），用相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定肝組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)含量。用ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子的血清水平，用Real-timePCR法檢測(cè)肝組織中炎癥信號(hào)相關(guān)分子P65的mRNA水平的變化。免疫組化p6

8、5染色觀察肝組織炎性改變，ki67染色觀察肝細(xì)胞增殖情況。用Western Blot法測(cè)定BCL-2、PARP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，用Western Blot法測(cè)定p65、IKBα、IKKα、IKKβ等分子的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、7d生存率:兩組在體重、手術(shù)時(shí)間、肝門阻斷時(shí)間、麻醉時(shí)間、術(shù)中失血量等方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組的7d生存率均為100％。
　　 2、肝功能及血常規(guī)變化:與NS組相比

9、，H2組TBIL術(shù)后第1至7d均顯著下降，TBIL同樣在術(shù)后第3d達(dá)到峰值，但峰值顯著下降;與NS組相比，H2組ALT，AST在術(shù)后第1至7d均顯著下降，同樣在術(shù)后第1日達(dá)到峰值，但峰值顯著下降。
　　 3、光鏡下病理改變:NS組術(shù)后7d可見肝細(xì)胞變性并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇內(nèi)皮剝脫、肝竇結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)門靜脈內(nèi)皮損傷等均較明顯;與NS組相比，H2組術(shù)后7d肝細(xì)胞腫脹、變性較輕，門管區(qū)靜脈內(nèi)皮損傷不明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)無明顯紊亂。<

10、br>　　 4、電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變:NS組術(shù)后7d可見細(xì)胞核固縮反應(yīng)，并可見凋亡小體形成，線粒體出現(xiàn)空泡，線粒體膜擴(kuò)張、嵴消失，胞漿內(nèi)空泡形成，。與NS組相比，H2組術(shù)后7d細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，未見明顯染色質(zhì)聚集，線粒體改變不明顯，未見明顯凋亡小體。
　　 5、肝組織氧化應(yīng)激的檢測(cè):與NS組相比，H2術(shù)后可見組織MDA含量明顯降低，SOD及CAT含量明顯升高。
　　 6、血清中IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子的

11、變化:與NS組相比，H2組IL-6、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。
　　 7、免疫組化染色:p65染色顯示，與NS組相比，H2組術(shù)后7天p65胞漿著色減弱，提示炎性反應(yīng)可能減輕。ki67染色顯示，與NS組相比，H2組術(shù)后7天ki67染色陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，提示肝細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)。
　　 8、肝組織中p65分子rnRNA水平的變化:與NS組相比，H2組p65分子mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜

12、0.05)。
　　 9、BCL-2、Cleaved PARP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:與NS組相比，H2組肝組織中Bcl-2抑凋亡蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Cleaved PARP的表達(dá)水平降低。
　　 10、肝組織p65、IKBα、IKKα、IKKβ等炎性轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)水平:與NS組相比，H2組p65表達(dá)明顯減少，而IKBα的表達(dá)明顯增加。IKKα、IKKβ的表達(dá)水平無明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1、氫生理