雷公藤甲素衍生物L(fēng)B-1抗胰腺癌作用及機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌是一種侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)、惡性程度高的實體腫瘤，傳統(tǒng)的放化療療法以及細(xì)胞毒類藥物對其療效有限，導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后差，病人生存期短。越來越多的臨床和臨床前研究數(shù)據(jù)表明低氧廣泛存在于胰腺癌中，而且低氧調(diào)控的缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor1α，HIF-1α）以及信號轉(zhuǎn)錄子和轉(zhuǎn)錄激活子-3(signaltransducer and activator of transcription-3，Stat3)在胰腺癌

2、中高表達(dá)。HIF-1α和Stat3作為信號通路關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控的下游基因眾多，其中大多數(shù)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，二者調(diào)控的基因多數(shù)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖、血管生成、誘導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移和改變腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程等。目前已有一些針對HIF-1α和Stat3抑制劑的研究開發(fā)，但是到目前為止，尚沒有一個特異性地靶向HIF-1α或Stat3而抗腫瘤的新藥上市。因此靶向HIF-1α和Stat3治療胰腺癌的新藥研究顯得尤為重要。
　　雷公藤甲

3、素(Triptolide，LA)來源于中藥雷公藤(T.wilfordii)。近期研究表明LA可以通過抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)揮抗卵巢癌作用。但是LA水溶性差、毒性大限制了該化合物的開發(fā)。為此，有必要對LA進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。在結(jié)構(gòu)修飾的系列化合物中，LB-1是一個結(jié)構(gòu)全新、毒性較低且易于合成的LA衍生物。因此，本文針對LB-1的作用及機(jī)制進(jìn)行了較為深入地研究。
　　我們從以下兩個方面展開研究，旨在探討:①LB-1是否通過影響HIF-

4、1α和Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗胰腺癌的作用，確切的機(jī)制如何;②LB-1是否影響侵襲轉(zhuǎn)移的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)這一過程，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　一、LB-1通過抑制HIF-1α和Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗胰腺癌作用及機(jī)制研究
　　1.LA及其衍生物對HIF-1抑制活性的篩選
　　應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HRE-U251和pGL3-U251

5、細(xì)胞篩選模型，評價LB-1對HIF-1α的抑制作用。結(jié)果顯示，LB-1對HIF-1有明顯抑制活性，IC50在10-7mol/L水平，呈良好的量效關(guān)系，而LB-1對HIF-1的抑制活性并非由LB-1的細(xì)胞毒性作用引起。
　　2.蛋白質(zhì)組學(xué)評價HRE-U251細(xì)胞篩選模型，并初步探討LB-1作用機(jī)制
　　采用同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolutequantit

6、ation，iTRAQ)標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)對HRE-U251細(xì)胞篩選模型進(jìn)行驗證并對LB-1潛在的作用靶點(diǎn)進(jìn)行初步探索。結(jié)果顯示，低氧促進(jìn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)(z-score＞2)，如HIF-1α，TGFβ1，STAT4，NFκB，TGFβ3等。加入LB-1后，可以顯著降低ANGPT2，HIF-1α，p38MAPK等蛋白的表達(dá)（z-score＜-1）。說明HRE-U251細(xì)胞篩選模型用于篩選HIF-1α抑制劑的可行性以及LB-1可

7、能通過抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　3.LB-1體內(nèi)外抗腫瘤作用研究
　　應(yīng)用MTT和克隆形成方法對LB-1的體外抗腫瘤作用進(jìn)行檢測。MTT結(jié)果顯示，LB-1與LA對來源于不同組織和器官的實體腫瘤細(xì)胞株均具有一定的生長抑制活性，且兩個化合物對人胰腺癌Mia-PaCa2和SW1990細(xì)胞的生長抑制活性相當(dāng)。集落形成實驗進(jìn)一步驗證了MTT實驗的結(jié)果。
　　采用人胰腺癌Mia-PaCa2裸鼠異體移植瘤模型對

8、LB-1發(fā)揮抗胰腺癌的體內(nèi)藥效進(jìn)行評價。結(jié)果顯示，LB-1可明顯抑制Mia-PaCa2裸鼠異體移植瘤的生長，腹腔注射LB-11.0mg/kg、2.0mg/kg和4.0mg/kg，抑瘤率分別為36.06％、57.1％和68.39％，具有良好的劑量依賴關(guān)系。腹腔注射LB-18.0mg/kg達(dá)到最大藥效，抑瘤率為95.16％，灌胃給予LB-18.0mg/kg對人胰腺癌Mia-Paca2裸鼠異體移植瘤也有明顯的生長抑制作用，抑瘤率為80.81％

9、，說明LB-1口服有效。無論是腹腔注射還是口服給予LB-1，裸鼠體重降低較為平緩，與LA相比，LB-1的毒性較低，安全性較好。
　　4.LB-1抗胰腺癌作用機(jī)制研究
　　采用shRNA有效地敲除SW1990細(xì)胞中的HIF-1α，MTT結(jié)果提示，HIF-1α的敲除部分地阻斷了LB-1的細(xì)胞毒作用。蛋白免疫印跡(western blotting)和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time reverse transcripti

10、on-polymerase chain reaction，Q-PCR)結(jié)果顯示，LB-1通過泛素蛋白酶體通路促進(jìn)HIF-1α蛋白降解，并抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活，LB-1對HIF-1α的這種抑制作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。進(jìn)一步研究表明，LB-1顯著降低低氧條件下p-Stat3的蛋白表達(dá)。為了進(jìn)一步證明LB-1抑制Stat3的激活與HIF-1α的活性有關(guān)，應(yīng)用shRNA技術(shù)有效地敲除了Stat3。Western blotting結(jié)果顯示，St

11、at3 shRNA不僅降低了p-Stat3和Stat3的蛋白水平，也降低了HIF-1α和靶基因血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的蛋白水平，Stat3shRNA和LB-1共同處理組表現(xiàn)出對靶基因VEGF的聯(lián)合抑制作用。免疫共沉淀(Co-IP)實驗顯示LB-1可顯著抑制p-Stat3、HIF-1α和p300形成復(fù)合物的能力。Q-PCR、酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-lin

12、ked immunosorbent assay，ELISA)和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)血管形成實驗進(jìn)一步表明，LB-1明顯抑制VEGF水平。與體外結(jié)果相一致，體內(nèi)LB-1（4.0mg/kg）處理組明顯抑制HIF-1α、p-Stat3、Stat3蛋白水平以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和

13、核糖體40s小亞基S6蛋白激酶(ribosomal S6 kinase P70，P70S6K)磷酸化水平。Q-PCR實驗分析，LB-1能一定程度上抑制HIF-1α和VEGF基因水平。
　　因此，作用機(jī)制研究表明，LB-1通過抑制HIF-1α和p-Stat3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，共同發(fā)揮抗胰腺癌增殖和抗血管生成的作用，同時LB-1對HIF-1α的抑制可能部分地通過抑制上游信號通路磷脂酰肌醇(-3)激酶（phosphatidylinositol

14、3-kinase，PI3K）/Akt/mTOR實現(xiàn)的。
　　二、 LB-1逆轉(zhuǎn)EMT過程，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移作用及機(jī)制研究
　　Transwell實驗中，LB-1抑制Mia-PaCa2和SW1990細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，具有明顯的量效關(guān)系，而且LB-1發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力并非由于化合物的細(xì)胞毒性引起。在體內(nèi)成功地建立了SW1990-G-luc裸鼠胰腺原位移植瘤模型。接下來對LB-1發(fā)揮抑制胰腺原位移植

15、瘤生長及侵襲轉(zhuǎn)移作用進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)LB-1能在一定程度上抑制胰腺癌的生長并具有降低侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　目前研究表明，EMT是包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤浸潤、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。Western blotting和Q-PCR結(jié)果顯示，LB-1顯著提高上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，降低間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、3-catenin和轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail表達(dá)。激光共聚焦顯徽鏡(Confocal)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗證了

16、western blotting和Q-PCR結(jié)果。為了明確Snail在LB-1逆轉(zhuǎn)EMT過程中發(fā)揮的作用，采用Snail過表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染胰腺癌Mia-PaCa2和SW1990細(xì)胞，結(jié)果顯示Snail過表達(dá)并不能完全消除LB-1誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞上皮特性的產(chǎn)生。接下來采用HIF-1αshRNA有效地敲除胰腺癌SW1990細(xì)胞中的HIF-1α，結(jié)果顯示，HIF-1αshRNA能夠有效地逆轉(zhuǎn)EMT過程，LB-1處理細(xì)胞并末觀察到更進(jìn)一步地逆轉(zhuǎn)

17、EMT過程的現(xiàn)象，說明HIF-1α在LB-1對EMT過程的調(diào)節(jié)中起到了至關(guān)重要的作用。
　　應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和western blotting評價了LB-1對細(xì)胞周期的影響并觀察相關(guān)周期蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，LB-1可將細(xì)胞周期明顯阻滯在S期。
　　流式細(xì)胞術(shù)-FITC-AnnexinⅤ/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染結(jié)果顯示，LB-1可顯著誘導(dǎo)腫瘤絀胞凋亡。同時，LB-1明顯上調(diào)C-Caspase9、C

18、-Caspase8、C-Caspase3和C-PARP的表達(dá)，下調(diào)Caspase9、Caspase8、Caspase3和PARP的表達(dá)。說明LB-1可能是通過激活內(nèi)源性和外源性凋亡兩條途徑激活Caspases家族基因誘導(dǎo)胰腺癌凋亡，最終剪切降解PARP，引起DNA修復(fù)的抑制并啟動DNA的降解。
　　綜上，LB-1作為潛在的HIF-1α和Stat3的抑制劑，一方面通過抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平和Stat3的蛋白聚集，減少與p-Sta