雷公藤內(nèi)酯醇調(diào)控5-LOX及抑制胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度極高預(yù)后極差的常見腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。由于早期診斷困難、高度侵襲性以及對常規(guī)治療不敏感，亟待進(jìn)行胰腺癌相關(guān)基礎(chǔ)研究，積極尋找有效的抗癌藥物。近年來研究表明，5一脂氧合酶(5-LOX)代謝途徑通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制其凋亡，對胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，干擾5-LOX通路能夠有效的抑制胰腺癌細(xì)胞生長。雷公藤內(nèi)酯醇(TL)是從我國中草藥中提取的有效活性成分，廣泛應(yīng)用于自身免疫病、移植排斥等。

2、研究發(fā)現(xiàn)它具有抑制5-LOX代謝途徑的作用，并能夠阻止多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前尚無TL抑制胰腺癌細(xì)胞中5-LOX表達(dá)和對胰腺癌增殖、凋亡影響的相關(guān)報(bào)道。本課題旨在探討5-LOX在胰腺癌組織中的表達(dá)規(guī)律及其與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的關(guān)系；研究TL在體外對胰腺癌細(xì)胞增殖凋亡、5-LOX表達(dá)及其代謝產(chǎn)物生成的影響；并進(jìn)一步研究TL對胰腺癌裸鼠移植瘤的生長和血管生成的抑制作用；最后通過表達(dá)譜芯片分析TL作用早期胰腺癌細(xì)

3、胞中基因表達(dá)變化，探討TL在抑制胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制以及是否具有潛在的臨床治療價(jià)值。 第一部分5-LOX在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與VEGF的關(guān)系 目的：研究5-LOX和VEGF在胰腺癌中的表達(dá)規(guī)律及其與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系，同時(shí)探討兩者表達(dá)的相關(guān)性，為胰腺癌的防治提供有關(guān)的理論依據(jù)。 方法：收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院2004年8月-2005年12月普通外科手術(shù)切除22例胰腺癌患者新鮮組織標(biāo)本及15例胰腺癌旁組

4、織；26例胰腺癌組織石蠟標(biāo)本來自南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科；5例正常胰腺組織標(biāo)本來自南通市法院尸檢。應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測5-LOX和VEGFmRNA在胰腺癌等組織中的表達(dá)；應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SP)方法檢測5-LOX蛋白在胰腺癌、癌旁組織和正常胰腺組織石蠟標(biāo)本中的表達(dá)。 結(jié)論： 1．5-LOX代謝途徑參與了胰腺癌病情的進(jìn)展，并與癌癥侵襲有一定關(guān)系。 2．VEGF基因表達(dá)在胰腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)

5、后中發(fā)揮重要作用。 3．胰腺癌5-LOX與VEGF基因表達(dá)存在一定相關(guān)性，5-LOX調(diào)節(jié)新生血管生成可能是其促進(jìn)腫瘤生長的重要機(jī)制之一。 第二部分雷公藤內(nèi)酯醇對人胰腺癌細(xì)胞SWl990增殖及凋亡的影響 目的：研究TL對體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞株SWl990中5-LOX及其代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4的抑制作用以及對細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。 方法：采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度TL對SWl990細(xì)胞的生長抑制作用

6、；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測TL對LTB4濃度的影響；RT-PCR檢測TL對5-LOX和bcl-2、bax及caspase-3基因表達(dá)的影響，Western-blot檢測5-LOX蛋白表達(dá)情況；采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)分析TL對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。 結(jié)論： 1．TL抑制SWl990細(xì)胞生長增殖，并呈明顯濃度和時(shí)間依賴性。 2．TL能部分通過抑制5-LOX代謝途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。 3．促凋亡作

7、用是TL抑制胰腺癌發(fā)展的重要途徑。 第三部分雷公藤內(nèi)酯醇對人胰腺癌細(xì)胞SWl990裸鼠移植瘤的抑制作用 目的：評價(jià)TL對胰腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響，分析TL在體內(nèi)對5-LOX蛋白表達(dá)及腫瘤新生血管生成的抑制作用，探討TL是否具有潛在的臨床抗腫瘤治療價(jià)值。 方法：將人胰腺癌細(xì)胞SWl990接種至裸鼠背部皮下，待移植瘤長至約150mm3左右分6組，腹腔注射給藥：丙二醇對照組(A組)：20％丙二醇對照液0．2ml，

8、每天一次；TL低劑量組(B組)：TL0．125mg／kg，每天一次；TL中劑量組(C組)：TL0．25mg／kg，每天一次；TL高劑量組(D組)：TL0．5mg／kg，每天一次；ADM組(E組)：阿霉素1．2mg／kg，每周一次；聯(lián)合用藥組(F組)：TL0．25mg／kg，每天一次；阿霉素1．2mg／kg，每周一次。觀察TL對裸鼠移植瘤的生長抑制作用。免疫組化分析TL對移植瘤的5-LOX、VEGF蛋白表達(dá)的影響；RT-PCR檢測TL對V

9、EGF基因表達(dá)影響；微血管密度(MVD)測定TL對血管生成的抑制作用。 結(jié)論： 1．TL對人胰腺癌細(xì)胞SWl990裸鼠移植瘤生長具有顯著的抑制作用，在一定范圍內(nèi)隨TL劑量的增加抑制作用增強(qiáng)。 2．TL可能部分通過抑制5-LOX和新生血管生成干預(yù)腫瘤的生長。 3．TL與ADM聯(lián)合用藥可能具有協(xié)同抑制腫瘤生長的作用。 第四部分雷公藤內(nèi)酯醇對人胰腺癌細(xì)胞株SWl990基因表達(dá)譜的影響 目的：應(yīng)用

10、基因表達(dá)譜芯片研究胰腺癌細(xì)胞株SWl990在TL作用后其基因表達(dá)的差異性。 方法：用Cy5和Cy3兩種熒光染料通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將加藥組和對照組的SWl990細(xì)胞的mRNA分別標(biāo)記成兩種探針，并與載有一組靶基因的表達(dá)譜芯片雜交，通過掃描熒光強(qiáng)度，計(jì)算機(jī)軟件分析，尋找經(jīng)TL作用早期表達(dá)有差異的基因。對芯片結(jié)果中兩個(gè)表達(dá)有改變的基因行熒光定量PCR驗(yàn)證。 結(jié)論：雷公藤內(nèi)酯醇可能部分通過下調(diào)C-Myc，Ets2，TGIF，RTP8