龍葵堿誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：黑色素瘤(malignant melanoma， MM)是一種高度惡性的腫瘤，占皮膚惡性腫瘤的第三位，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，死亡率高，預(yù)后差。因此尋找安全有效的治療藥物成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。各國學(xué)者一直致力于研發(fā)高效、敏感的抗黑色素瘤藥物。目前，中草藥及其有效成分是腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新方向。龍葵堿(solanine)又名茄堿，是馬鈴薯中一種主要的甾體生物堿。近年來發(fā)現(xiàn)，龍葵堿具有抗病原微生物、抗腫瘤等作用，其抗腫瘤作用受到眾多學(xué)者關(guān)注。目前

2、，已有研究證實(shí)龍葵堿對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，但其對黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用研究很少。本研究主要通過龍葵堿處理黑素瘤A375細(xì)胞，觀察其對A375細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)凋亡蛋白的影響，探討龍葵堿可能的抗腫瘤作用機(jī)制，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)。將黑色素瘤A375細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DME M培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.采用CCK8法檢測龍

3、葵堿對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖抑制率的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組(只加培養(yǎng)基無細(xì)胞無龍葵堿)，陰性對照組(加含有細(xì)胞的培養(yǎng)基，無龍葵堿)和實(shí)驗(yàn)組(加含有細(xì)胞的培養(yǎng)基和以下濃度的龍葵堿4.6μmol/L、9.2μmol/L、13.8μmol/L、18.4μmol/L、23.0μmo l/L)，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h、48 h、72h后加入CC K8檢測龍葵堿對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖活力的影響，計(jì)算不同濃度的增值抑制率及IC50值。

4、>　　3.倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察不同濃度的龍葵堿誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。設(shè)陰性對照組(無龍葵堿)及實(shí)驗(yàn)組(龍葵堿濃度為9.2μmo l/L、13.8μmo l/L、18.4μmo l/L)。培養(yǎng)24小時(shí)后分別于倒置顯微鏡和DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)學(xué)變化。
　　4.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測凋亡相關(guān)基因(Caspa

5、se-3、Bcl-2及Bax)在mRNA水平的表達(dá)。
　　5.應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Bc l-2及Bax)的表達(dá)情況。
　　6.應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以-x±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較采用S NK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　

6、1.未經(jīng)龍葵堿作用的黑色素瘤A375細(xì)胞呈菱形生長，大小一致，形態(tài)規(guī)整，細(xì)胞貼壁良好，增殖旺盛(Fig.2,3)；
　　2. CCK8結(jié)果示，不同濃度的龍葵堿作用黑色素瘤A375細(xì)胞24h抑制率分別為(2.0±2.4)%、(11.4±1.4)%、(36.6±1.8)%、(63.7±0.3)%、(68.4±1.4)%，經(jīng)兩兩比較4.6μmol/L與陰性對照組的抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其余組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

7、5)；作用48h抑制率分別為(7.6±3.0)%、(15.3±2.8)%、(60.9±3.4)%、(76.6±2.9)%、(78.6±3.8)%，經(jīng)兩兩比較18.4μmol/L與23.0μmol/L的抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；作用72h抑制率分別為(16.3±1.4)%、(28.7±3.7)%、(64.8±4.4)%、(95.8±1.2)%、(101.1±4.5)%，經(jīng)兩兩比較18.

8、4μmol/L與23.0μmol/L的抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig.4,5,Table1)。實(shí)驗(yàn)組龍葵堿作用黑色素瘤A375細(xì)胞24h、48h、72h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別是16.2μmol/L、12.9μmo l/L、11.8μmo l/L。因此我們選取9.2μmo l/L、13.8μmo l/L、18.4μmo l/L的龍葵堿濃度作用24h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
　　3

9、.倒置顯微鏡下觀察，陰性對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，輪廓清楚，大小一致，胞漿飽滿，遮光性強(qiáng)，細(xì)胞貼壁良好且增殖旺盛；實(shí)驗(yàn)組龍葵堿作用24h細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，體積變小，輪廓不規(guī)整，細(xì)胞皺縮，遮光性差，細(xì)胞脫落，貼壁不良，懸浮細(xì)胞增多(Fig.6,7)。DAPI染色后通過熒光顯微鏡觀察，陰性對照組細(xì)胞核大小一致，均勻分布，實(shí)驗(yàn)組龍葵堿作用24h細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮、核邊集及凋亡小體形成(Fig.8)。且隨著龍葵堿濃度的升高，細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化越顯著；

10、
　　4.RT-qPCR結(jié)果示，不同濃度的龍葵堿作用黑色素瘤A375細(xì)胞24h, Bax基因在 mRNA水平表達(dá)量依次為1.370±0.335，1.721±0.711，2.371±0.494，陰性對照組為1.064±0.516，經(jīng)兩兩比較對照組與9.2μmol/L、13.8μmol/L與18.4μmo l/L之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig.9,Table2)；Caspase

11、-3基因在mRNA水平表達(dá)量依次為1.346±0.289，1.619±0.299，2.338±0.033，對照組為1.018±0.267，經(jīng)兩兩比較對照組、9.2μmol/L與13.8μmo l/L之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig.11,Table2);Bc l-2基因在 m R NA水平表達(dá)量依次為0.975±0.109，0.705±0.228，0.360±0.110，對照組為1

12、.007±0.166，經(jīng)兩兩比較對照組與18.4μmol/L、9.2μmol/L與18.4μmol/L之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(Fig.10,Table2)；
　　5.Westernblot結(jié)果示，不同濃度的龍葵堿作用黑色素瘤A375細(xì)胞24h, Bax蛋白表達(dá)量依次為0.543±0.049，0.824±0.059，0.857±0.046，陰性對照組為0.440±0.039，

13、經(jīng)兩兩比較濃度為13.8μmol/L與18.4μmol/L之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig.12,13, Table3)；Caspase-3蛋白表達(dá)量依次為0.409±0.050，0.526±0.029，0.613±0.050，陰性對照組為0.403±0.037，經(jīng)兩兩比較濃度為9.2μmol/L與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

14、0.05)(Fig.12,15, Table3)；Bcl-2蛋白表達(dá)量依次為0.275±0.026，0.145±0.018，0.045±0.018，陰性對照組為0.254±0.021，經(jīng)兩兩比較濃度為9.2μmo l/L與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(Fig.12,14, Table3)。
　　結(jié)論：
　　1.在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，龍葵堿對黑色素瘤A375細(xì)胞