RIP-1促進膽囊癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機制.pdf

1、目的：業(yè)已證明TNF-α具有促進膽囊癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。然而作為 TNF-α-TNFR1信號通路的關(guān)鍵蛋白 RIP1(receptor-interacting protein-1，受體相互作用蛋白-1)，其對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用及其具體的分子機制鮮見報道。本研究擬圍繞以下問題開展實驗：RIP1在膽囊癌中的表達及與臨床參數(shù)之間的關(guān)系；進一步進行體外細胞實驗，探討RIP1對膽囊癌細胞增殖、凋亡、侵襲及對VEGF-C表達的影響及其機

2、制。
　　方法：收集60例膽囊癌和17例癌旁正常組織石蠟標本，通過免疫組織化學法檢測RIP1的蛋白表達；結(jié)合臨床資料分析RIP1表達與臨床參數(shù)間的關(guān)系。通過RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測3個膽囊癌細胞株中RIP1的表達情況。通過RNAi技術(shù)特異性的沉默膽囊癌細胞中RIP1；RT-PCR、Western-blot驗證；通過細胞增殖實驗（MTT）、Transwell小室侵襲實驗、流式細胞儀檢測凋亡實驗檢測 RIP1基因

3、沉默對膽囊癌細胞生物學行為的影響。通過 Western-blot分析RIP1基因沉默對 AKT、p-AKT、NF-κB（p65）、p-NF-κB（p-p65）、c-jun（AP-1）、p-c-jun(p-AP-1)、VEGF-C蛋白表達的影響。構(gòu)建VEGF-C啟動子截短缺失體片段及各個突變體雙熒光素酶報告載體，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測各啟動子片段活性，確定 VEGF-C啟動子關(guān)鍵活性區(qū)域，通過生物信息學分析預測關(guān)鍵活性區(qū)域存在關(guān)

4、鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、通過重疊 PCR方法定點誘變技術(shù)突變特定轉(zhuǎn)錄因子位點對 VEGF-C啟動子活性的影響、進一步細胞外實驗凝膠電泳遷移率阻滯實驗（EMSA）和活體細胞實驗染色質(zhì)免疫共沉淀實驗（ChIP）確定RIP1通過NF-κB和AP-1調(diào)控VEGF-C基因啟動子的活性。
　　結(jié)果：⑴RIP1在膽囊癌組織中的表達（MOD值=0.3134±0.0802）顯著高于膽囊正常組織（MOD值=0.1345±0.1220），P＜0.0001；

5、RIP1的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學分級無關(guān)；而RIP1的表達與膽囊癌患者的臨床分期（I～III vs.IV～V；P=0.0021）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無轉(zhuǎn)移組 vs.有轉(zhuǎn)移組；P=0.047）和有無結(jié)石（有結(jié)石vs.無結(jié)石；P=0.0382）相關(guān)。⑵RIP1的mRNA和蛋白在三株膽囊癌細胞系均有表達，NOZ細胞RIP1蛋白表達最強。構(gòu)建的沉默質(zhì)粒 P-1/siRNA—P-4/siRNA中 P-1/siRNA最大程度沉默了NOZ

6、細胞的RIP1表達，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05。P-1/siRNA組細胞增殖比NC/siRNA組和control組（即未轉(zhuǎn)染組）細胞緩慢（P＜0.05），而NC/siRNA組和 control組細胞增殖無差異（P＞0.05）。P-1/siRNA組細胞穿到下室的細胞數(shù)比 NC/siRNA組和 control組細胞數(shù)目少，差異有統(tǒng)計學意義 P＜0.05；而NC/siRNA組和 control組穿到下室的細胞數(shù)目無差異（P＞0.05）。P-

7、1/siRNA、NC/siRNA和 control組膽囊癌細胞的凋亡情況無差異。P-1/siRNA組細胞中 AKT、p-AKT、NF-κB（p65）、p-NF-κB（p-p65）、c-jun（AP-1）、p-c-jun(p-AP-1)蛋白表達量比 NC/siRNA組和 control組表達量少，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05；而NC/siRNA組和control組表達無差異（P＞0.05）。P-1/siRNA組VEGF-C mRNA和蛋白

8、的表達量比NC/siRNA組和control組表達量減少，結(jié)果有顯著差異P＜0.05；而NC/siRNA組和control組VEGF-C mRNA和蛋白表達無差異（P＞0.05）。⑶332bp到-190bp是VEGF-C啟動子保持轉(zhuǎn)錄表達活性的關(guān)鍵區(qū)域。VEGF-C啟動子片段 PGL3B-332的熒光活性隨著 RIP1的表達升高而升高，呈劑量效應(yīng)增加；發(fā)現(xiàn) VEGF-C啟動子-332bp至-190bp區(qū)域存在兩個交錯重疊的AP-1位點（

9、-207 to-192bp GGCGCGTCAGTCATG；兩個 AP-1位點分別為：GGCGCGTCAGT和CGTCAGTCATG），調(diào)控VEGF-C啟動子活性。⑷證實RIP1可激活NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在VEGF-C啟動子-332bp至-190bp區(qū)域，增強VEGF-C啟動子活性；
　　結(jié)論：①RIP1在膽囊癌組織中的表達顯著增加；RIP1的表達與膽囊癌患者的臨床分期、有無結(jié)石以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。②RIP1促進膽

10、囊癌細胞的增殖和侵襲，對凋亡無影響；RIP1促進膽囊癌細胞RIP1-NF-κB/AP-1-VEGF-C信號通路分子的表達。③332bp到-190bp是VEGF-C啟動子保持轉(zhuǎn)錄表達活性的關(guān)鍵區(qū)域。在 VEGF-C啟動子-332bp到-190bp區(qū)域存在兩個AP-1結(jié)合位點，是調(diào)控VEGF-C啟動子活性的重要位點。④RIP1通過NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子與VEGF-C基因啟動子結(jié)合位點結(jié)合調(diào)控VEGF-C啟動子的活性，從而影響VEGF-