蟬花發(fā)酵生產(chǎn)免疫活性組分ISP的研究.pdf

1、蟬花(Cordyceps cicadae)是我國傳統(tǒng)的名貴藥用蕈菌(medicinal mushroom)。因其與冬蟲夏草一樣同屬蟲菌復(fù)合體，且含有相近的化學(xué)成分，所以醫(yī)家常作冬蟲夏草的代用品，具有極高的藥用價值?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，ISP是其重要的生物活性組分，具有顯著的免疫抑制作用，其中主要成分為多球殼菌素(ISP-1)。無論在細(xì)胞生長周期，對環(huán)境的污染還是產(chǎn)物的積累方面，發(fā)酵培養(yǎng)蟬花生產(chǎn) ISP都具有其獨特的優(yōu)越性，具有重要的應(yīng)用價

2、值。本論文研究了大孔吸附樹脂分離純化蟬花ISP的洗脫工藝，并建立起一種新的快捷有效測定ISP的方法。在此基礎(chǔ)上，為獲得高產(chǎn)ISP的最佳培養(yǎng)條件，考察了培養(yǎng)基碳源和氮源對蟬花細(xì)胞生長和ISP生產(chǎn)的影響，并且通過對碳源和氮源的優(yōu)化，顯著提高了蟬花發(fā)酵生產(chǎn) ISP的產(chǎn)量。
　　(1)研究了大孔吸附樹脂分離純化蟬花ISP的洗脫工藝，探討了乙醇解吸濃度對分離純化效果的影響。采用薄層色譜對ISP的分離純化進行定性的跟蹤檢測，并使用HPLC-M

3、S聯(lián)用確證了我們的結(jié)論。建立起蟬花ISP的分離純化工藝為：選用NKA型非極性大孔吸附樹脂對其進行分離純化，上柱液以1BV/h的速度流過樹脂，待吸附平衡后，用4BV的水以2BV/h的速度淋洗樹脂，再用4BV的50％乙醇以2BV/h的速度淋洗樹脂，流出液棄之，然后用95%的乙醇溶液以1BV/h的流速進行洗脫，收集4BV的洗脫液，60℃減壓濃縮至干，甲醇溶解，即得ISP類次生代謝產(chǎn)物甲醇溶液。將ISP甲醇溶液通過正丁醇萃取，可顯著提高ISP的

4、含量，達(dá)到蟬花免疫抑制有效部位的標(biāo)準(zhǔn)。
　　(2)使用茚三酮比色法測定蟬花發(fā)酵液中的ISP的含量，探討了此顯色反應(yīng)的影響因素、反應(yīng)條件，通過線性和范圍、精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度等指標(biāo)評價該方法，并通過與薄層色譜結(jié)果之比較印證該方法的準(zhǔn)確性，建立起一種快捷有效測定蟬花免疫活性組分ISP的方法。
　　(3)通過搖瓶培養(yǎng)，研究了蟬花細(xì)胞生長和ISP產(chǎn)物積累的動態(tài)變化過程。實驗結(jié)果顯示，蟬花細(xì)胞生長和ISP產(chǎn)量并不同步，分別在第8天和