蟬花菌種退化對其代謝的影響.pdf

1、蟬花（Isaria cicadae Miquel），也稱蟬棒束孢，是寄生在蟬上的一種蟲草菌。大量研究證實(shí)天然蟬花孢梗束和人工培養(yǎng)的孢梗束及其菌絲體含有多種活性物質(zhì)，具有顯著的生物學(xué)活性和藥理作用。與天然蟬花及冬蟲夏草相比，人工培養(yǎng)的蟬花安全性要比野生產(chǎn)品高，而且從野生資源和環(huán)境保護(hù)的角度考慮，蟬花的人工培養(yǎng)具有廣闊的前景。但是蟬花和其他絲狀菌一樣，菌株在人工培養(yǎng)基上傳代也會出現(xiàn)菌落形態(tài)和生長速率的改變等生物學(xué)性狀的變異，以及產(chǎn)孢梗束能力

2、和目標(biāo)活性物質(zhì)產(chǎn)量等生產(chǎn)性狀下降的退化現(xiàn)象，從而影響蟬花產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。本研究以蟬花的菌種退化現(xiàn)象為關(guān)注點(diǎn)，從蟬花菌種退化過程中的表型、代謝組以及生物活性的變化過程及相互關(guān)系，探討蟬花菌種退化機(jī)理和影響。
　　對蟬花在人工培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)菌株的生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明，蟬花菌株在人工培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)過程中生物學(xué)性狀表現(xiàn)出階段性的變異，菌株的產(chǎn)孢量隨著傳代次數(shù)的增加而下降，菌絲生長速度先隨傳代次數(shù)增加而加快，第8代之后生長速度減緩

3、。第8、9代是蟬花菌株繼代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)折階段。總地來看，繼代培養(yǎng)過程中菌落局變頻率沒有規(guī)律可循，其變異具有菌株的特異性。
　　基于代謝組學(xué)的分析結(jié)果，蟬花菌株在人工培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)過程可以分為四個(gè)階段:繼代培養(yǎng)第1～5代為第Ⅰ階段，第7代、第9代分別為第Ⅱ、Ⅲ階段，第11～15代為第Ⅳ階段。蟬花各代菌株的代謝物差異與菌株的表型差異在一定程度上形成對應(yīng)關(guān)系，傳代第Ⅱ階段與菌絲生長和產(chǎn)孢力相關(guān)的物質(zhì)如膽堿、甜菜堿、磷脂等物質(zhì)顯著高于第Ⅰ

4、階段即繼代培養(yǎng)前5代，代謝物先于菌株的表型差異表達(dá)，具有一定的先兆性。蟬花菌株在人工培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)過程中受到脅迫作用，第9代是一個(gè)關(guān)鍵階段，在此階段與氧化脅迫反應(yīng)或菌株抗性相關(guān)的氧脂素類物質(zhì)、甜菜堿類物質(zhì)、海藻糖、甘露醇、檸檬酸以及丙酮酸等物質(zhì)均顯著高于第Ⅰ階段。綜合蟬花表型差異研究和代謝組學(xué)研究結(jié)果可知，蟬花菌株由于在人工培養(yǎng)條件下受到氧化脅迫之類的環(huán)境脅迫作用，退化從繼代培養(yǎng)的第5代以后開始，第9代為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，生產(chǎn)意義上的退化即孢

5、梗束產(chǎn)生能力顯著下降即從這個(gè)階段開始。
　　對蟬花的三種不同培養(yǎng)方式產(chǎn)生的培養(yǎng)物，即平板固體發(fā)酵和液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲以及人工栽培產(chǎn)生的孢梗束，進(jìn)行基于代謝組學(xué)方法的差異代謝物分析，分析結(jié)果表明，培養(yǎng)條件對蟬花菌株的代謝影響顯著，不同的蟬花活性物質(zhì)適宜的培養(yǎng)方式不同。液體培養(yǎng)菌絲體中甜菜堿型氨基酸衍生物ulvaline、丙酮酸、N6-(2-羥基)腺苷等物質(zhì)較少;而甜菜堿、琥珀酸、V-PYRRO/NO、異喹啉堿ampullosin

6、e等物質(zhì)產(chǎn)量較高。固體平板培養(yǎng)菌絲體中香菇菌素、蜜環(huán)菌癸素，白僵菌素，海藻糖等物質(zhì)含量較高。人工栽培的孢梗束中膽堿、環(huán)絲氨酸、米曲霉麥角甾醇等物質(zhì)含量較高，而甘露醇，17-羥基亞油酸，8-羥基亞油酸等物質(zhì)的含量較低。固體平板培養(yǎng)物和人工栽培的孢梗束中N6-(2-羥乙基)腺苷含量均較高。這說明液體發(fā)酵和固體發(fā)酵培養(yǎng)方式均適用于產(chǎn)甘露醇的培養(yǎng)，而海藻糖更適宜采用固體發(fā)酵培養(yǎng)方式來獲得;液體發(fā)酵培養(yǎng)不適宜作為生產(chǎn)拮抗抑制劑N6-(2-羥乙基)

7、腺苷的培養(yǎng)方法。
　　用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對蟬花繼代培養(yǎng)菌株及角變菌株的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明蟬花實(shí)驗(yàn)菌株繼代培養(yǎng)15代菌株聚類成3組，前5代為一組，7～9代為一組，后5代為一組，這說明隨著傳代次數(shù)的增加，蟬花的基因組DNA也隨著繼代培養(yǎng)發(fā)生變異。變異表現(xiàn)出數(shù)量遺傳的特性，即隨著傳代次數(shù)的增加而不斷積累，到一定代數(shù)會表現(xiàn)出質(zhì)的變化。然而，在逆向的變異過程中，也會出現(xiàn)正向的回復(fù)變異。因此，蟬花菌種變異的情況是十分復(fù)雜的。該

8、研究結(jié)果與代謝組學(xué)分析結(jié)果形成一定程度的一致性:蟬花的15代菌株基于遺傳相似系數(shù)也是這樣聚為3類，G1、G3、G5代聚為一類，G7、G9聚為一類，G11、G13、G15聚為一類;這與代謝組學(xué)研究結(jié)果的聚類一致，說明有可能利用簡單的ISSR分析來判定復(fù)雜的蟬花代謝產(chǎn)物的變化。
　　對蟬花繼代培養(yǎng)菌株的清除自由基活性研究結(jié)果進(jìn)一步表明，蟬花供試菌株G1代清除自由基能力比較強(qiáng);各代菌株清除自由基能力表現(xiàn)出一定的階段性，G7和G9代是其中

9、的轉(zhuǎn)折階段。這與表型差異研究、代謝組學(xué)分析以及ISSR分析結(jié)果基本一致，確證蟬花繼代培養(yǎng)7～9代為變異和退化發(fā)生的重要轉(zhuǎn)折階段。三種不同培養(yǎng)方式獲得的蟬花培養(yǎng)物在清除自由基活性方面表現(xiàn)出差異性。固體平板培養(yǎng)菌絲體清除DPPH活性較弱，液體培養(yǎng)菌絲體清除·OH自由基活性較弱，而人工栽培獲得的孢梗束清除兩種自由基的活性均較高。
　　綜合以上研究結(jié)果，在蟬花的繼代培養(yǎng)中，由于人工培養(yǎng)條件與其自然生長條件有很大差別，導(dǎo)致對蟬花產(chǎn)生脅迫作用