肝癌微球體細胞特異性結(jié)合七肽的篩選.pdf

1、目的：篩選能夠與高轉(zhuǎn)移性HCCLM3肝癌微球體特異性結(jié)合的環(huán)七肽，為后續(xù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供靶向分子。
　　方法：利用超低吸附培養(yǎng)瓶和無血清培養(yǎng)基對HCCLM3進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其形成肝癌微球體。以肝癌微球體為靶細胞，HCCLM3和 LO2為吸附細胞，應(yīng)用噬菌體環(huán)七肽庫進行全細胞差減篩選。四輪篩選后，隨機挑選噬菌體單克隆進行測序；根據(jù)測序結(jié)果，采用cell-ELISA對不同類型噬菌體克隆與肝癌微球體結(jié)合的親和力和特異性進行檢測。根據(jù)特異

2、性最高的噬菌體克隆的融合蛋白基序來合成對應(yīng)的環(huán)七肽。使用競爭抑制試驗檢驗合成多肽對噬菌體克隆與靶細胞結(jié)合的抑制作用。運用激光共聚焦顯微鏡進一步驗證合成多肽與肝癌微球體結(jié)合的特異性。細胞毒性試驗檢測多肽的生物學(xué)活性。
　　結(jié)果：通過懸浮培養(yǎng)，LM3細胞成功聚集成球形成微球體，四輪差減篩選后，噬菌體克隆在肝癌微球體的富集率從（8.50×10-5±1.70×10-5）%提高到（1.0×10-2±4.08×10-4）%(P<0.001)。

3、cell-ELISA結(jié)果顯示P26號噬菌體克隆與肝癌微球體結(jié)合的特異性最高，其展示多肽的氨基酸序列為 NTGSPYE(命名為NTG肽)。競爭抑制試驗結(jié)果表明：NTG肽對P26噬菌體與肝癌微球體的結(jié)合有抑制作用（P<0.01或P<0.001）。運用激光共聚焦顯微鏡觀察標記FITC的NTG肽與細胞結(jié)合的結(jié)果顯示：NTG肽能與肝癌微球體特異性結(jié)合，而與無關(guān)細胞則不發(fā)生結(jié)合。細胞增殖試驗顯示：NTG肽對細胞生長沒有增殖活性。
　　結(jié)論：用