GPC3在肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移及侵襲中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，以亞洲和非洲高發(fā)。近些年西方發(fā)達(dá)國家的HCC發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，尤其是美國和加拿大。我國是世界上HCC高發(fā)地區(qū)之一，每年發(fā)病人數(shù)約為30萬人，位于常見腫瘤的第3位。此外，我國肝癌的年死亡率為20.40/10萬，其中城市為19.98/10萬，農(nóng)村為23.59/10萬，分別居惡性腫瘤死亡率的第二位和第一位。手術(shù)切除仍然是治愈早期肝癌的最佳選擇，

2、然而，即使是根治性切除之后，60％-70％的患者在術(shù)后5年內(nèi)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。盡管一些臨床因素（如腫瘤分化程度、腫瘤大小、是否脈管侵潤等）與患者預(yù)后密切相關(guān)，但是HCC的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制目前仍不明確，因此，探索肝癌的發(fā)病基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，尋找肝癌早期診斷、預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的生物指標(biāo)和靶向治療的靶點(diǎn)，是目前腫瘤學(xué)研究的迫切任務(wù)之一。
　　 硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)是一類攜帶一條或多條硫酸乙酰肝素鏈的蛋白。這些肝素鏈

3、是由長線狀的葡糖醛酸聚合物/N-乙酰氨基葡糖重復(fù)雙糖單位組成。鏈的長度高度均可變，大部分雙糖單位都受N-去乙?；?、去硫酸化、差向異構(gòu)化和O-去硫酸化的調(diào)節(jié)。去乙?；T導(dǎo)了硫酸乙酰肝素鏈產(chǎn)生高強(qiáng)度的負(fù)電荷，從而允許硫酸乙酰肝素糖蛋白以較為雜亂的方式與帶有正電荷區(qū)域的蛋白產(chǎn)生相互作用，其中包括了一些所謂的“肝素結(jié)合生長因子”，如成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)，Wnt，Hedgehogs(Hhs)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)。磷脂酰肌醇蛋白聚

4、糖(GPC)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族中的一員，它的成員通過磷脂酰肌醇錨(GPI)連接于細(xì)胞表面。哺乳動(dòng)物的基因組包括了GPC家族的六個(gè)成員:（GPC1至GPC6），還有其他兩個(gè)成員在果蠅中發(fā)現(xiàn)（dally和dlp）。
　　 GPC3基因定位于人染色體Xq26.1區(qū)，編碼的GPC3蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為70Kda，由580個(gè)氨基酸組成。GPC3的核心蛋白由兩個(gè)部分組成，分別40kDa的GPC3氨基端(N-)片段及30kDa的GPC

5、3羧基端(C-)片段。1996年，Pilia等首先報(bào)道了GPC3基因突變和功能缺失的患者出現(xiàn)了過度生長綜合征(SGBS)，這是一種X連鎖異常的疾病，主要表現(xiàn)為產(chǎn)前、產(chǎn)后胎兒的過度生長，并伴有廣泛的內(nèi)臟和骨骼的異常，同時(shí)還會(huì)增加胚胎源性腫瘤發(fā)生的可能性。隨后的研究又表明，GPC3的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的比例失調(diào)，而這可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。GPC3還可與肝素結(jié)合型蛋白相結(jié)合，如基質(zhì)成分、細(xì)胞粘附分子、酶和酶抑制物、生長因

6、子等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、粘附和遷移等生理過程等，除此之外，其還可能參與調(diào)節(jié)一部分中胚層組織和器官發(fā)育的過程。隨后有大量的研究報(bào)道表明GPC3在肝細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤、Wilm's瘤、大腸癌、肝胚細(xì)胞瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤高表達(dá)，而在間皮瘤、乳腺癌、肺腺癌以及卵巢癌中表達(dá)顯著下調(diào)，提示GPC3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
　　 本課題組前期已完成以下的研究工作:應(yīng)用免疫組化及組織芯片技術(shù)，通過檢測(cè)36例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織和3

7、3例原發(fā)性肝癌癌旁組織以及一些其他常見腫瘤組織和其癌旁組織中GPC3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明:(1)36例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織及33例原發(fā)性肝細(xì)胞癌癌旁組織中GPC3蛋白的表達(dá)率分別為66.17％(24/36)，3.0％(1/33)，兩者之間差異有顯著性;(2) GPC3蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌、肺鱗癌、癌旁慢性淺表性胃炎組織中表達(dá)，而乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌組織中無表達(dá);(3)原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中GPC3蛋白表達(dá)與患

8、者性別、年齡、病理分級(jí)無顯著相關(guān)性。隨后我們收集和分析了61例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患(HCC)者術(shù)后標(biāo)本切片，比較GPC3高表達(dá)患者與GPC3低表達(dá)患者之間的生存時(shí)間差異。結(jié)果表明，GPC3的表達(dá)與接受手術(shù)患者的轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)高度相關(guān)，GPC3高表達(dá)的術(shù)后患者發(fā)生轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)患者的3.214倍。生存分析顯示GPC3高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后顯著差于低表達(dá)者。此外，多變量分析提示GPC3在HCC中是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)參數(shù)。同時(shí)，我們還采用了

9、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)法分別檢查HCC30例，其他肝臟源性腫瘤8例，其他肝臟疾病（如肝炎、肝硬化、肝良性腫瘤）13例，以及25例正常人血清標(biāo)本中GPC3及甲胎蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，血清GPC3蛋白水平診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌的敏感性和特異性分別為50％和92％，聯(lián)合甲胎蛋白檢測(cè)可以使診斷敏感性從50％提升至73.3％。GPC3蛋白水平的增高提示原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者腫瘤分化低、臨床TN

10、M分期晚、肝硬化程度明顯。以上臨床數(shù)據(jù)提示GPC3在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，故我們采用micro RNA對(duì)肝癌發(fā)生的分子機(jī)理進(jìn)行研究。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-219-5p在83例HCC腫瘤組織中及3株肝癌細(xì)胞株中顯著下調(diào)，其與HCC患者的預(yù)后、病理分級(jí)、腫瘤大小密切相關(guān);在細(xì)胞學(xué)上，miR-219-5p能抑制細(xì)胞增殖。進(jìn)一步研究表明，miR-219-5p負(fù)性調(diào)節(jié)GPC3表達(dá)，在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。綜上所述，GPC3蛋白是具有前景的

11、特異性HCC腫瘤標(biāo)志物，可用于HCC的診斷及判斷預(yù)后，并可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 在前期研究的工作基礎(chǔ)上，擬應(yīng)用RNA干擾和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)一步探討GPC3在肝癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲過程中的作用。針對(duì)來源于同一遺傳背景，但具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株MHCC-97H和MHCC-97L，應(yīng)用載體轉(zhuǎn)染方法使GPC3在細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)或上調(diào)，來觀察GPC3在體外肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用;同時(shí)，擬將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞注射至裸鼠皮下，觀察腫瘤生

12、長速度，從而明確GPC3在體內(nèi)肝癌形成過程中的作用。本文旨在探討GPC3作為肝癌的腫瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的可能性，為肝癌患者的早期診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后及治療手段提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.檢測(cè)肝癌細(xì)胞株MHCC-97H和MHCC-97L的GPC3表達(dá)水平通過western blot和熒光定量PCR檢測(cè)兩株細(xì)胞的GPC3蛋白/基因表達(dá)量，以一株正常肝細(xì)胞作為對(duì)照，從而驗(yàn)證高低轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞株的GPC3表達(dá)情況，為下一步

13、實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　 2.上調(diào)MHCC-97L的GPC3表達(dá)量以觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響上一步實(shí)驗(yàn)已證明MHCC-97L的GPC3表達(dá)量較低，故采用基因重組技術(shù)及限制性內(nèi)切酶技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體p-EGFP-C3-GPC3，經(jīng)鑒定后通過脂質(zhì)體lipo2000轉(zhuǎn)染至MHCC-97L中，通過流式細(xì)胞儀篩選帶熒光的細(xì)胞，經(jīng)G418培養(yǎng)后建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPC3的細(xì)胞株，最后通過western blot和熒光定量PCR檢測(cè)GPC3在細(xì)胞

14、表達(dá)情況。以空載體p-EGFP-C3及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照，通過MTT、細(xì)胞克隆、transwell等實(shí)驗(yàn)，觀察三組細(xì)胞的生物學(xué)行為差異。最后，通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察三組細(xì)胞體內(nèi)的腫瘤增殖能力。
　　 3.下調(diào)MHCC-97H的GPC3表達(dá)量以觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響首先設(shè)計(jì)了4對(duì)靶向GPC3的shRNA，合成后插入pGenesil-1 shRNA表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

15、細(xì)胞株，使用western blot及熒光定量PCR檢測(cè)各組GPC3表達(dá)情況，篩選表達(dá)量最低一組用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以空載體及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照，通過MTT、細(xì)胞克隆、transwell等實(shí)驗(yàn)，觀察三組細(xì)胞的生物學(xué)行為差異。最后，通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察三組細(xì)胞體內(nèi)的腫瘤增殖能力。
　　 4.GPC3影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制探討我們選取Akt通路作為研究對(duì)象，通過WB來檢測(cè)通路上的相關(guān)分子（包括Akt和磷酸化Akt）在各組細(xì)胞中的表達(dá)

16、。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)、腫瘤體積觀察均采用析因設(shè)計(jì)方差分析比較各組間差異;對(duì)比轉(zhuǎn)染前后和干擾前后肝癌細(xì)胞株的GPC3蛋白和RNA水平、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、Akt和p38蛋白和RNA表達(dá)水平采用單因素方差分析;多重比較采用LSD法，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

17、r>　　 1.GPC3在肝癌細(xì)胞株MHCC-97H和MHCC-97L中的表達(dá)結(jié)果表明，以正常肝細(xì)胞作為對(duì)照，肝癌細(xì)胞MHCC-97H的GPC3的蛋白及核酸表達(dá)水平較高，差異具有顯著性(P=0.000);而與MHCC97H相比較，MHCC-97L的GPC3表達(dá)水平較低，差異具有顯著性(P=0.000)。
　　 2.穩(wěn)定表達(dá)GPC3對(duì)肝癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響持續(xù)使用G418進(jìn)行篩選后，轉(zhuǎn)染p-EGFP-C3-GPC3和p-EGF

18、P-C3細(xì)胞形成明顯克隆，然后進(jìn)行擴(kuò)增，最終成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GPC3的MHCC-97L細(xì)胞和空白載體細(xì)胞，分別命名為MHCC-97L/GPC3和MHCC-97L/con。通過westernblot和qPCR進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，MHCC-97L/GPC3的GPC3表達(dá)水平較MHCC-97L/con和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97L顯著升高(P=0.000)，而MHCC-97L/con和未轉(zhuǎn)染MHCC-97L細(xì)胞間的GPC3表達(dá)水平無差異(P＞0.

19、05)。
　　 通過MTT法和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞體外增殖情況。MHCC-97L/GPC3、MHCC-97L/con和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97L在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖速度有顯著差異(P＜0.05)。MHCC-97L/GPC3隨著時(shí)間的推移，增殖速度明顯加快，與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，而MHCC-97L/con和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97L的增殖速度則無顯著差異(P＞0.05)。此外，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與M

20、HCC-97L/con和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97L相比，MHCC-97L/GPC3的細(xì)胞活力顯著提高(P=0.000)。
　　 細(xì)胞體外遷移和侵襲小室檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)特異性GPC3基因后細(xì)胞遷移侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MHCC-97L/GPC3細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力明顯高于MHCC-97L/con和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97L細(xì)胞(P=0.000);此外，侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，與MHCC-97L/con和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97L細(xì)胞相比，MH

21、CC-97L/GPC3細(xì)胞的侵襲能力亦是明顯增高(P=0.000)。
　　 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)GPC3基因后細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。將裸鼠隨機(jī)分成3組，分別皮下注射MHCC-97L/GPC3，MHCC-97L和MHCC-97L/con細(xì)胞，然后觀察21天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MHCC-97L/GPC3注射組裸鼠皮下腫瘤體積明顯大于對(duì)照組(P=0.000)。21天后處死裸鼠，將腫瘤稱重，MHCC-97L/GPC3，MHCC-97L和MHCC-

22、97L/con三組的腫瘤平均重量分別為2.987±0.168g，1.801±0.015g和1.758±0.040g， MHCC-97L/GPC3組的瘤重顯著大于MHCC-97L和MHCC-97L/con組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，而MHCC-97L和MHCC-97L/con組之間的瘤重則無顯著差異(P＞0.05)。
　　 3.GPC3基因表達(dá)沉默對(duì)肝癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響MHCC97-H細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pGenesil

23、-1-GPC3-shRNA1，2，3，4和pGenesil-1-negative，隨后持續(xù)使用G418進(jìn)行篩選，最終成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GPC3的MHCC-97L細(xì)胞和空白載體細(xì)胞，分別命名為MHCC97-H/GPC3-shRNA1，2，3，4和MHCC97-H/con-shRNA。通過western blot和qPCR進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，MHCC97-H/GPC3-shRNA1的GPC3表達(dá)水平較MHCC97-H/con-shRNA和未轉(zhuǎn)

24、染的MHCC-97H顯著下降(P=0.000)，而MHCC97-H/con-shRNA和未轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞間的GPC3表達(dá)水平無差異(P＞0.05)。因此選擇MHCC97-H/GPC3-shRNA1作進(jìn)一步的研究對(duì)象。
　　 通過MTT法和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞體外增殖情況。MHCC97-H/GPC3-shRNA1、MHCC97-H/con-shRNA和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97H在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖速度有顯著差異(P=0.

25、000)。MHCC97-H/GPC3-shRNA1的增殖速度較慢，與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，而MHCC97-H/con-shRNA和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97H的增殖速度則無顯著差異(P＞0.05)。此外，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與MHCC97-H/con-shRNA和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97H相比，MHCC97-H/GPC3-shRNA1的細(xì)胞活力顯著減弱(P=0.000)。
　　 細(xì)胞體外遷移和侵襲小室檢測(cè)

26、GPC3基因沉默后肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MHCC97-H/GPC3-shRNA1細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力明顯低于MHCC97-H/con-shRNA和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97H細(xì)胞(運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)遷移細(xì)胞數(shù)目分別為4.647±1.319、14.774±1.112和15.770±2.025，P=0.000);此外，侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，與MHCC97-H/con-shRNA和未轉(zhuǎn)染的MHCC-97H細(xì)胞相比，MHCC-97L/GPC3細(xì)胞

27、的侵襲能力亦是明顯降低(透膜細(xì)胞數(shù)分別為4.421±1.536,15.902±1.450，和14.374±2.015, P=0.000)。
　　 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GPC3基因敲除后細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。將裸鼠隨機(jī)分成3組，分別皮下注射 MHCC97-H/GPC3-shRNA1， MHCC-97H和MHCC97-H/con-shRNA細(xì)胞，然后觀察21天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MHCC97-H/GPC3-shRNA1注射組裸鼠皮下腫瘤體積明顯小于對(duì)

28、照組(P=0.000)。21天后處死裸鼠，將腫瘤稱重，MHCC97-H/GPC3-shRNA1，MHCC-97H和MHCC97-H/con-shRNA三組的腫瘤平均重量分別為1.541±0.096g，2.424±0.095g和2.402±0.080g，MHCC97-H/GPC3-shRNA1組的瘤重顯著小于MHCC-97H和MHCC97-H/con-shRNA組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.000)，而MHCC-97H和MHCC97-H/

29、con-shRNA組之間的瘤重則無顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.GPC3過表達(dá)（或沉默）能促進(jìn)（或抑制）Akt通路的活化結(jié)果表明，當(dāng)GPC3表達(dá)沉默時(shí)，MHCC97-H/GPC3-shRNA1細(xì)胞的磷酸化Akt較對(duì)照組顯著下降(P=0.000);而當(dāng)GPC3表達(dá)上調(diào)時(shí)，MHCC-97L/GPC3細(xì)胞的磷酸化Akt水平則較對(duì)照組顯著升高(P=0.000)。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

30、成功構(gòu)建了GPC3高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株，初步探討了GPC3的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生物學(xué)行為的影響，發(fā)現(xiàn)GPC3能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵潤能力。
　　 2.同時(shí)利用質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建了GPC3表達(dá)沉默的肝癌細(xì)胞株，進(jìn)一步驗(yàn)證了GPC3對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為有著重要的正性調(diào)節(jié)作用，是肝癌的促癌因子。
　　 3.GPC3過表達(dá)（或沉默）能促進(jìn)（或抑制）磷酸化Akt的表達(dá)，故認(rèn)為，GPC3促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移

31、作用的部分機(jī)制可能是通過促進(jìn)Akt通路的活化來實(shí)現(xiàn)的。
　　 創(chuàng)新之處：
　　 1.成功建立了GPC3過表達(dá)細(xì)胞株MHCC-97L/GPC3和GP.C3表達(dá)沉默細(xì)胞株MHCC97-H/GPC3-shRNA1，為進(jìn)一步深入研究GPC3在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中的作用提供了有效的途徑。
　　 2.初步探索了GPC3促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，提示GPC3的促腫瘤生長作用和Akt通路存在密切的聯(lián)系，GPC3促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移