視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的感染性眼內(nèi)炎中的致病作用.pdf

1、細(xì)菌性眼內(nèi)炎是眼外傷或內(nèi)眼手術(shù)后常見的致盲性并發(fā)癥，而視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能的損害是致盲的主要原因。在感染性眼內(nèi)炎，感染引起的視網(wǎng)膜炎癥可導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障的破壞、視網(wǎng)膜內(nèi)大量外周血來源的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和視網(wǎng)膜解剖學(xué)結(jié)構(gòu)破壞，如感光細(xì)胞層皺褶和脫離、或視網(wǎng)膜各細(xì)胞層完全溶解崩潰，最終視網(wǎng)膜功能喪失。在感染性眼內(nèi)炎，導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的破壞的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)的確切免疫機(jī)制目前并不清楚，因而，臨床上可有效地抑制視網(wǎng)膜炎癥和給視網(wǎng)膜提供神經(jīng)保護(hù)作用的

2、治療措施相當(dāng)缺乏。
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的一種固有的組織型巨噬細(xì)胞。最近的研究表明在CNS神經(jīng)退行性疾病和感染性疾病如腦膿腫、多種病毒和原蟲性感染等病理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可導(dǎo)致神經(jīng)損害。米諾環(huán)素(MC)，一種半合成的第二代四環(huán)素衍生物，無論是在感染性或非感染性CNS疾病，均可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性并對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，展示出一種有益的免疫調(diào)控潛能。

3、然而，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在感染性眼內(nèi)炎中的致病作用和米諾環(huán)素能否在眼內(nèi)細(xì)菌性感染引起的宿主免疫炎癥性反應(yīng)的發(fā)揮調(diào)控作用，目前尚未見相關(guān)研究。對(duì)感染性眼內(nèi)炎的宿主和致病菌之間的相互作用的分子和細(xì)胞學(xué)的機(jī)制的進(jìn)行充分的研究，可為發(fā)展新的眼內(nèi)炎治療策略提供新的靶向。本研究目標(biāo)是設(shè)計(jì)出一種可精確區(qū)分視網(wǎng)膜內(nèi)被激活的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞和外周血來源的浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞的方法，并探討視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的眼內(nèi)炎中的致病作用；最后，我們對(duì)米諾環(huán)素在細(xì)菌脂

4、多糖誘導(dǎo)的感染性眼內(nèi)炎的治療作用進(jìn)行觀察。
　　 第一部分在體標(biāo)記視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞
　　 目的:對(duì)視神經(jīng)橫斷后的SD大鼠的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、分布和細(xì)胞密度進(jìn)行觀察。
　　 方法:將4-Di-10-ASP染料顆粒填充于視神經(jīng)鞘內(nèi)視神經(jīng)橫斷面以逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞。分別在視神經(jīng)橫斷后14，28，35，42和56天處死大鼠摘除眼球，視網(wǎng)膜以0X42和TNF-α行免疫組織化學(xué)染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、>　　 結(jié)果:在視神經(jīng)橫斷后14天可發(fā)現(xiàn)散在的4Di-10ASP標(biāo)記的節(jié)細(xì)胞。至28天節(jié)細(xì)胞則幾乎完全消失，OX-42和4Di-10ASP均呈陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞，主要分布于內(nèi)叢狀層(IPL)，節(jié)細(xì)胞層(GCL)，神經(jīng)纖維層(NFL)，也可見少量小膠質(zhì)細(xì)胞位于外叢狀層(OPL)。小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)上以呈現(xiàn)樹枝狀突起為主，胞體直徑較小。所有4Di-10ASP(+)細(xì)胞0X42均呈陽性；在視神經(jīng)橫斷后28，35，42和56天，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)

6、分別為350.8±14.21；360.2±21.47；336±9.91和341±12.65 cells/mm2,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在視神經(jīng)橫斷后28-56天內(nèi)，視網(wǎng)膜內(nèi)未見TNF-Q陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)論:熒光染料4Di-10ASP可特異性逆行標(biāo)記全部視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞。在視神經(jīng)橫斷后28至56天，這些細(xì)胞均處于穩(wěn)定的靜止?fàn)顟B(tài)。因此，本動(dòng)物模型可作為動(dòng)態(tài)跟蹤觀察視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活性和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)變化的理想平臺(tái)。
　　

7、第二部分視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)的眼內(nèi)炎中的致病作用
　　 目的:觀察LPS眼內(nèi)注射后視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)變化，并探討其在LPS誘導(dǎo)的感染性眼內(nèi)炎中的致病作用。
　　 方法:將SD大鼠以4-Di-10-ASP染料顆粒填充于視神經(jīng)橫斷面逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞。在視神經(jīng)橫斷后28天，向玻璃體腔內(nèi)注入LPS以建立感染性眼內(nèi)炎動(dòng)物模型。在LPS注射后不同時(shí)點(diǎn)處死大鼠摘除眼球，視網(wǎng)膜以O(shè)X42、IL-1β、TNF-α

8、行免疫組織化學(xué)染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 結(jié)果:LPS玻璃體腔內(nèi)注入后3小時(shí)，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞主要位于GCL和IPL，此部位的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較NS對(duì)照組(350±11cell/mm2)有較明顯的增加(分別為3小時(shí)后458±45.6 Cell/mm2和6小時(shí)后477±87 Cell/mm2,兩組均P<0.05)，而冰凍切片則顯示視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞主要位于NFL和IPL，在OPL，幾乎檢測(cè)不到視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞。視網(wǎng)

9、膜小膠質(zhì)細(xì)胞呈多種形態(tài)，由雙極狀或多分支狀變?yōu)榘w變大，呈阿米巴樣外觀，突起變短。此時(shí)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞已表達(dá)TNF-α和IL-1β。LPS玻璃體腔內(nèi)注入后3小時(shí)，在視網(wǎng)膜小血管內(nèi)僅可見圓形白細(xì)胞(OX42(+)/4-Di-10ASP(-)細(xì)胞)開始貼壁并粘附于血管內(nèi)壁。至LPS玻璃體腔內(nèi)注入后6小時(shí)后，大量炎癥細(xì)胞已浸潤(rùn)至視網(wǎng)膜內(nèi)。
　　 結(jié)論:在LPS誘導(dǎo)的感染性眼內(nèi)炎的早期，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，向視網(wǎng)膜內(nèi)層遷移，由雙極、

10、多分支狀的狹長(zhǎng)形態(tài)變?yōu)榇蟀w、分支粗短的阿米巴樣外觀，并表達(dá)促炎因子TNFα和IL-1β；這些小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移和活化發(fā)生在外周炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)入視網(wǎng)膜之前，這提示在LPS誘導(dǎo)的感染性眼內(nèi)炎，視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞可能起啟動(dòng)眼內(nèi)炎癥，招募血液中的炎癥細(xì)胞導(dǎo)致炎癥的擴(kuò)大的關(guān)鍵作用。
　　 第三部分米諾環(huán)素對(duì)LPS誘導(dǎo)的感染性眼內(nèi)炎的治療作用
　　 目的:探討米諾環(huán)素在LPS誘導(dǎo)的感染性眼內(nèi)炎的治療作用。
　　 方法:首先建立L

11、PS誘導(dǎo)的SD大鼠眼內(nèi)炎動(dòng)物模型。在LPS注射前12小時(shí)及其后連續(xù)7天每天向上SD大鼠腹腔內(nèi)注射米諾環(huán)素(50mg/Kg溶于0.2ml生理鹽水)。在LPS注入后的不同時(shí)點(diǎn)，對(duì)眼部炎癥分別進(jìn)行臨床和組織病理學(xué)檢查，并測(cè)定前房水蛋白質(zhì)濃度。
　　 結(jié)果:在LPS注射后3小時(shí)，兩組大鼠均在前房出現(xiàn)閃輝和細(xì)胞纖維素性滲出。在L，PS眼內(nèi)注入后12至24小時(shí)，兩組大鼠LPS誘導(dǎo)的眼內(nèi)炎癥反應(yīng)均達(dá)到高峰，在第3天后迅速減輕。在LPS注射后所

12、有時(shí)點(diǎn)，在米諾環(huán)素治療組大鼠可以觀察到明顯的臨床炎癥減輕和前房纖維素性滲出減少。炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，與對(duì)照組比較，米諾環(huán)素治療組浸潤(rùn)至玻璃體腔內(nèi)的炎癥細(xì)胞明顯減少(在LPS注射后24小時(shí)分別為356±55和1125±65.6)。米諾環(huán)素治療組在各時(shí)點(diǎn)可觀察到前房蛋白濃度輕度下降，但種差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:米諾環(huán)素可明顯抑制白細(xì)胞的眼內(nèi)浸潤(rùn)并有效減輕LPS誘導(dǎo)的感染性眼內(nèi)炎炎癥反應(yīng)，但不能改善血眼屏障的破壞。這些結(jié)果進(jìn)一步