轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子FHL2在舌鱗狀細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、口腔頜面部惡性腫瘤的發(fā)病率居全身惡性腫瘤的第六位，而其中至少有80％是鱗狀細(xì)胞癌?？谇击[狀細(xì)胞癌惡性程度較高，且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，術(shù)后常繼發(fā)畸形，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成極大的影響。舌鱗狀細(xì)胞癌(oraltongue squamous cell carcinoma OTSCC)是口腔癌中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占口腔鱗癌的40％以上，其發(fā)病率、致死率位于口腔腫瘤的首位。近年來(lái)舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，有發(fā)病低齡化的傾向。在過(guò)

2、去的20年里，雖然傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)、放療、化療等都有一定程度的發(fā)展，但是口腔癌的預(yù)后仍然不能達(dá)到讓人滿意的效果;目前其5年生存率也只有50％～60％左右，并且大約1/3的患者會(huì)復(fù)發(fā);另外，經(jīng)過(guò)手術(shù)治療的患者吞咽、語(yǔ)言功能及面部容貌等受到較大影響，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。因此，人們對(duì)新的治療方法如基因治療、免疫治療、靶向腫瘤干細(xì)胞治療等生物治療手段的關(guān)注越來(lái)越多。這些技術(shù)通常是通過(guò)特異性地作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、信號(hào)傳導(dǎo)通路中特定的酶位

3、點(diǎn)及腫瘤細(xì)胞增殖、分裂、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中相關(guān)基因等的特定靶點(diǎn)，特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)又極少損傷正常的人體細(xì)胞，能大大地降低對(duì)人體的毒性反應(yīng)。
　　 FHL2(Four and a half LIM domains2)是LIM蛋白家族LIM-only亞類中的成員，LIM蛋白被定義為有一個(gè)或多個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域、可以調(diào)節(jié)蛋白與蛋白間的相互作用的蛋白質(zhì)。FHL2蛋白由279個(gè)氨基酸組成，包括4.5個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域;最初是在心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)

4、，主要參與心肌細(xì)胞的分化及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控。近期研究表明FHL2在多種組織的細(xì)胞分化及癌癥發(fā)生方面發(fā)揮重要作用，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子的功能，是雄激素受體(androgen receptor，AR)、cAMP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)、激活蛋白1(activatorprotein1，AP-1)及胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth fa

5、ctorbinding protein5，IGFBP-5)等多種轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)節(jié)因子，在器官分化、發(fā)育、細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)重建及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。目前認(rèn)為，F(xiàn)HL2在多種腫瘤（包括前列腺癌，肝癌、卵巢上皮細(xì)胞癌等）的發(fā)生發(fā)展演化過(guò)程以及在腫瘤細(xì)胞的分化過(guò)程中起重要的作用，并且其作用具有組織依賴性，在一些腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌及胃癌中表達(dá)上調(diào)，起轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而在另一些組織如肝癌中

6、表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共抑制因子的作用，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。FHL2作用廣泛，且在不同癌組織中發(fā)揮不同的作用，而它與舌鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系目前尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道。
　　 本課題擬通過(guò)體內(nèi)及體外研究，利用免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、Real-time PCR及Western blot等技術(shù)，檢測(cè)FHL2在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及分布情況，初步探討FHL2在舌鱗狀細(xì)胞癌中可能發(fā)揮的作用;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FHL2真核表達(dá)載體，增強(qiáng)FHL2在舌鱗狀細(xì)胞癌

7、細(xì)胞系中的表達(dá)，并將FHL2過(guò)表達(dá)細(xì)胞系接種于裸鼠皮下，觀察對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響，分析FHL2與舌鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性及其作用機(jī)制，以期為臨床提供新的治療思路與方法。
　　 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本課題共包括三部分:
　　 第一部分FHL2在不同分化水平舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及分布研究
　　 在病理科收集舌鱗狀細(xì)胞癌病理切片，利用免疫組化的方法觀察并檢測(cè)FHL2在腫瘤組織中的表達(dá)與分布情況，對(duì)比不同分化水平舌鱗

8、癌細(xì)胞及癌旁組織之間FHL2表達(dá)的差異。初步探討FHL2在舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮的作用。
　　 第二部分FHL2過(guò)表達(dá)對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113生物學(xué)行為的影響
　　 利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)增強(qiáng)FHL2在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113中的表達(dá)，采用MTT、Transwell、Real-time PCR、Western blot及流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察FHL2對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括細(xì)胞增殖

9、、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、侵襲遷移情況及可能的相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的影響，探討FHL2在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用及其可能的信號(hào)路徑機(jī)制。
　　 本部分有三個(gè)實(shí)驗(yàn)組成:
　　 1.FHL2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的建立。
　　 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將pcDNA3.0-FHL2基因轉(zhuǎn)入舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tea8113中，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FHL2過(guò)表達(dá)的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系模型pcDNA3.0-FHL2-Tca8113，同時(shí)建

10、立空載體舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系模型pcDNA3.0-Tca8113。
　　 2.FHL2過(guò)表達(dá)對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響。
　　 利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕等實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)三組細(xì)胞（舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113、FHL2過(guò)表達(dá)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系pcDNA3.0-FHL2-Tca8113及空載體舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系pcDNA3.0-Tca8113）之間細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等

11、生物學(xué)特性的差異，分析FHL2過(guò)表達(dá)對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 3.FHL2在舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的初步研究。
　　 利用Real-time PCR及Western blot等技術(shù)檢測(cè)三種細(xì)胞系Tca8113、pcDNA3.0-FHL2-Tca8113及pcDNA3.0-Tca8113中舌鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)基因NF-KB、β-catenin等的表達(dá)情況，初步探討FHL2調(diào)控舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中

12、的分子機(jī)制。
　　 第三部分舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113中FHL2過(guò)表達(dá)對(duì)裸鼠成瘤的影響
　　 將三種細(xì)胞系Tca8113、pcDNA3.0-FHL2-Tca8113及pcDNA3.0-Tca8113植入裸鼠皮下，選取3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、24天、27天及30天，觀察腫瘤的生長(zhǎng)趨勢(shì)，對(duì)比三組之間的差別，分析FHL2過(guò)表達(dá)對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的影響。
　　 結(jié)論:
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