Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后及治療中的作用研究.pdf

1、口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。目前，口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療方法仍然是以手術(shù)治療為主，并輔以放射治療和化學(xué)藥物治療。近年來，隨著手術(shù)方式的不斷改進(jìn)以及輔助手段的加強(qiáng)，口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療效果也逐步得以改善，但其五年生存率仍不足50％。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，腫瘤的基因治療已經(jīng)成為惡性腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)。由于基因治療具有特異性強(qiáng)、損傷小、對原發(fā)灶及

2、轉(zhuǎn)移灶均有效的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療和化療之后的新的有希望的治療手段。因此，尋找可用于口腔鱗狀細(xì)胞癌治療的靶基因?qū)τ诳谇击[狀細(xì)胞癌的治療具有十分重要的意義。生長抑制和DNA損傷基因(growth arrest-and DNAdamage-inducible，Gadd)45基因家族由 Gadd45α/Gadd45a，Gadd45β/Gadd45b/myd118及Gadd45γ/Gadd45g/cr6組成。其中，Gadd45a基因是DN

3、A.損傷后誘導(dǎo)表達(dá)的基因之一，也是抑癌基因p53和乳腺癌相關(guān)蛋白1(Breast Cancer Associated Protein1，BRCA1)的下游靶基因。細(xì)胞DNA損傷后，Gadd45a基因可以通過p53依賴及非依賴兩條途徑被誘導(dǎo)表達(dá)升高，參與細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)及信號傳導(dǎo)等重要細(xì)胞生命活動的調(diào)節(jié)，并由此介入了對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控。已有研究發(fā)現(xiàn)，Gadd45a在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均存在表

4、達(dá)異常。但是，國內(nèi)外關(guān)于Gadd45a與口腔鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系的研究尚未見報道。
　　 目的：①Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義；②Gadd45a基因沉默對舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響；③Gadd45a基因沉默對舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞放療敏感性的影響。
　　 方法：⑴收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院：2003-2009年切除的原發(fā)性人口腔鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)標(biāo)本106例，患者均行腫瘤局部擴(kuò)大切除

5、術(shù)及頸淋巴清掃術(shù)，術(shù)后病理明確診斷。患者的臨床資料包括年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等同時被收集整理。另外選取60例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的癌旁組織作為對照。⑵采用免疫組化方法檢測Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)及定位，并分析Gadd45a蛋白表達(dá)及定位與患者臨床資料之間的關(guān)系。⑶x2檢驗被用來分析Gadd45a在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系

6、。⑷采用免疫熒光技術(shù)觀察Gadd45a蛋白在Tca8113細(xì)胞中的表達(dá)定位。⑸采用RNA干擾技術(shù)沉默Tca8113細(xì)胞中Gadd45a基因的表達(dá)：設(shè)計并合成Gadd45a的特異性干擾序列及無意義對照序列，轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后48h及72h收集細(xì)胞，通過realtime quantitive RT-PCR及 Western Blot方法檢測Gadd45a-siRNA的特異性及有效性。⑹采用MTT法檢測Gadd45a基因沉默

7、對Tca8113細(xì)胞增殖能力的影響：將5×103個Tca8113細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)40％時，將Gadd45a-siRNA及對照序列轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24h、48b及72h，用Biotek酶聯(lián)免疫檢測儀檢測細(xì)胞在490nm的吸光度值。⑺特異性靶向人Gadd45a的siRNA序列及無意義對照序列分別轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24小時收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測Gadd45a基因沉默對Tca8113細(xì)

8、胞周期的影響。⑻將轉(zhuǎn)染Gadd45a-siRNA及無意義對照序列的Tca8113細(xì)胞以0.25％的胰酶消化、計數(shù)并接種于Transwell上層小室，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，觀察Gadd45a基因沉默對Tca8113細(xì)胞遷移能力的影響。⑼對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)到70％融和時，分別給予0Gy、4Gy、10Gy的射線照射，照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，通過倒置顯微鏡及細(xì)胞HE染色觀察不同劑量射線

9、照射對Tca8113細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。⑽對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)到70％融和時，分別給予0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、10Gy的射線照射，照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測放射線對Tca8113細(xì)胞凋亡的影響。⑾對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞達(dá)到40％融和時，將Gadd45a-siRNA及對照序列轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24h，分別給予0

10、Gy、2Gy、4Gy、8Gy、10Gy的射線照射，照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，利用MTT法觀察Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組經(jīng)射線照射后細(xì)胞存活情況。⑿對數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞達(dá)到40％融和時，將Gadd45a-siRNA及對照序列轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后24h，分別給予0Gy、4Gy、10Gy的射線照射，照射后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，流式細(xì)胞術(shù)分析Gadd4

11、5a-siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組經(jīng)放射線照射后細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：①口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織的免疫組化染色結(jié)果顯示：口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織均高表達(dá)Gadd45a蛋白。并且，Gadd45a蛋白表達(dá)存在兩種表達(dá)模式，一種是細(xì)胞漿和細(xì)胞核均著色，細(xì)胞核占優(yōu)勢，我們稱之為細(xì)胞核模式；另一種是細(xì)胞漿著色明顯，細(xì)胞核不著色或著色淺，我們稱之為細(xì)胞漿模式。60例癌旁組織中，Gadd45a的表達(dá)均為細(xì)胞核表達(dá)模式。而在106例口腔鱗狀細(xì)

12、胞癌組織中，只有60例表現(xiàn)為細(xì)胞核模式，其余46例的陽性著色部位以細(xì)胞漿為主，細(xì)胞核著色淺或不著色，為細(xì)胞漿模式。近一步的統(tǒng)計分析表明，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中Gadd45a表達(dá)模式的轉(zhuǎn)換與患者的年齡、腫瘤的組織學(xué)分級、腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在密切的關(guān)系。年齡≤60歲的腫瘤患者組織中，Gadd45a的表達(dá)以細(xì)胞漿模式為主，而年齡>60歲的腫瘤患者組織中，Gadd45a的表達(dá)以細(xì)胞核模式為主(p<0.05)。Gadd45a表達(dá)模式在不

13、同組織學(xué)分級的口腔鱗狀細(xì)胞癌之間存在顯著的差異(p<0.05)，高分化及中分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中Gadd45a的表達(dá)分布以細(xì)胞核模式為主，而在低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中Gadd45a的表達(dá)分布以細(xì)胞漿模式為主。72.2％的Ⅰ、Ⅱ期腫瘤患者組織中Gadd45a的表達(dá)以細(xì)胞核模式為主，而在Ⅲ、Ⅳ期腫瘤患者中以細(xì)胞核模式表達(dá)Gadd45a的組織標(biāo)本只占48.6％，二者間存在顯著的差異(p<0.05)。在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤患者組織標(biāo)本中，以

14、細(xì)胞漿模式表達(dá)Gadd45a的比例明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(p<0.05)。②Gadd45a在Tca8113細(xì)胞中的表達(dá)：為了研究Gadd45a基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，我們選擇高分化的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113作為研究對象。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，Gadd45a在Tca8113細(xì)胞中廣泛表達(dá)，其著色部位主要在細(xì)胞核，與高分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本中Gadd45a的表達(dá)模式基本一致。③Gadd45a-siRNA干

15、擾效率的檢測：為了證明Gadd45a-siRNA的特異性及有效性，real time quantitive RT-PCR及Western Blot方法被用來檢測Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組和對照組Tca8113細(xì)胞中Gadd45a的表達(dá)，結(jié)果顯示，靶向Gadd45a的siRNA有效抑制了Tca8113細(xì)胞中Gadd45a mRNA及蛋白水平的表達(dá)。④Gadd45a基因沉默對Tca8113細(xì)胞增殖的影響：我們利用MTT法檢測了Gadd

16、45a-siRNA轉(zhuǎn)染組與對照組Tca8113細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Gadd45a-siRNA的Tca8113細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48h及72h的增殖能力較對照組明顯增強(qiáng)。⑤Gadd45a基因沉默對Tca8113細(xì)胞周期的影響：利用siRNA技術(shù)將Tca8113細(xì)胞中的Gadd45a基因沉默以后24h，收集細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示，Gadd45a基因沉默導(dǎo)致Tca8113細(xì)胞G2/M期監(jiān)測點(diǎn)異常，處于G2期的細(xì)胞比

17、例明顯減少，而S期細(xì)胞的比例顯著增多(p<0.05)。⑥Gadd45a基因沉默對Tca8113細(xì)胞遷移能力的影響：Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組及對照組Tca8113細(xì)胞接種于Transwell上層小室，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，計數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)，觀察Gadd45a基因沉默對Tea8113細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，Gadd45a-siRNA轉(zhuǎn)染組遷移的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(p<0.05)，表明Gadd45a基因沉默增強(qiáng)了Tca811

18、3細(xì)胞的遷移能力。⑦通過倒置顯微鏡及HE染色技術(shù)觀察了不同劑量射線照射對Tca8113細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tca8113細(xì)胞經(jīng)10Gy射線照射后24h，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞間隙變寬，凋亡及壞死漂浮的細(xì)胞增多，細(xì)胞密度明顯低于未照射或低劑量照射組細(xì)胞。⑧MTT實(shí)驗被用來觀察放射線對Tca8113細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，4-10Gy放射線有效抑制了Tca8113細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性。⑨細(xì)胞周期PI染色顯示，10Gy射線照射導(dǎo)致了T

19、ca8113細(xì)胞G2/M期的阻滯，使處于G1及S期的細(xì)胞明顯減少。⑩Gadd45a基因沉默合并射線照射對Tca8113細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響：為了檢測Gadd45a基因沉默對Tca8113細(xì)胞放療敏感性的影響，我們首先利用real time quantitive RT-PCR和WesternBlot檢測了Gadd45a-siRNA的有效性，結(jié)果顯示Gadd45a-siRNA有效抑制了Tca8113細(xì)胞中Gadd45a基因及蛋白水平的表達(dá)(

20、P<0.05)。隨后我們采用MTT及流式細(xì)胞技術(shù)觀察了siRNA實(shí)驗組及對照組Tca8113細(xì)胞在接受不同劑量射線照射時細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)及凋亡情況的變化。MTT結(jié)果顯示，Tca8113細(xì)胞在受到4Gy及以上劑量射線照射時，siRNA實(shí)驗組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯高于對照組(P<0.05)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果也顯示，Tca8113細(xì)胞在受到4Gy及10Gy射線照射時，Gadd45a基因沉默組細(xì)胞的凋亡受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡分?jǐn)?shù)較對照組明顯下降(P<

21、0.05)。
　　 結(jié)論：⑴Gadd45a在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中存在細(xì)胞漿-細(xì)胞核表達(dá)模式的轉(zhuǎn)換，并且Gadd45a的表達(dá)模式與口腔鱗狀細(xì)胞癌的組織學(xué)分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。⑵Gadd45a在人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)缺失促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長和遷移，其機(jī)制可能是通過干擾細(xì)胞周期調(diào)控以及抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。⑶放射誘導(dǎo)的人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中Gadd45a基因表達(dá)升高促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對放療的敏感性。

22、r>　　 本研究創(chuàng)新性和意義：①本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是在國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)Gadd45a在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)存在細(xì)胞漿.細(xì)胞核表達(dá)模式的轉(zhuǎn)換，并且與患者的組織學(xué)分級及TNM分期有關(guān)。并通過體外實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)，Gadd45a基因表達(dá)缺失促進(jìn)了舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長及遷移。為以Gadd45a為靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療提供了理論依據(jù)。②本研究首次采用RNA干擾技術(shù)揭示，放射誘導(dǎo)的舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中Gadd45a的表達(dá)升高增強(qiáng)了人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對放療的