mir-373在食管鱗狀細(xì)胞癌中的功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、食管癌(esophageal carcinoma，EC)是全球第八大惡性腫瘤，死亡率高，5年生存率不到15％。在我國(guó)，食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，具有易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。近年來(lái)大量研究表明，miR-373在多種惡性腫瘤中均發(fā)揮了重要作用。Voorhoeve等人于2006年第一次提出miR-373,作為一個(gè)新的癌基因，它在睪丸精原細(xì)胞瘤中通過(guò)阻斷p53

2、通路來(lái)參與腫瘤的進(jìn)展。它也可以通過(guò)作用于靶基因PPP6C調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。而在乳腺癌中，通過(guò)監(jiān)測(cè)循環(huán)血中miR-373的表達(dá)含量可以了解是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另外，miR-373通過(guò)作用于Rab22a來(lái)抑制人卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮了抑癌基因的作用?；蛐酒夹g(shù)分析，miR-373在ESCC組織中表達(dá)上調(diào)，比正常組織至少高1.5倍。然而，miR-373在ESCC中的作用機(jī)制目前尚不清楚，尤其在血漿中的表達(dá)水平及意義目

3、前尚無(wú)研究。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一系列能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，通過(guò)破壞瘤細(xì)胞周?chē)慕M織學(xué)屏障，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。MMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)在正常人體內(nèi)環(huán)境中處于平衡狀態(tài)，由于腫瘤的特性，使兩者之間的平衡被打破，從而提高了腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的能力。其中基質(zhì)金屬蛋

4、白酶抑制劑-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3,TIMP3)與惡性腫瘤的關(guān)系密切，作為一種抑癌基因，TIMP3的低表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，還能抑制細(xì)胞凋亡。另外，通過(guò)檢測(cè)TIMP3在膀胱癌及ESCC中的表達(dá)水平，還可以推測(cè)患者的預(yù)后。在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)TIMP3與ESCC的遷移及侵襲能力密切相關(guān)，而通過(guò)生物信息學(xué)軟件的預(yù)測(cè)，我們也發(fā)現(xiàn)TIMP3可能為miR-373的靶基因。<

5、br>　　在本項(xiàng)研究中，我們檢測(cè)了miR-373在ESCC組織及血漿中的表達(dá)水平，并通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)使miR-373的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，觀察miR-373對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。尋找miR-373的直接靶基因，探討miR-373在ESCC發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制，為ESCC的診斷及治療提供了新的理論依據(jù)。
　　第一部分 miR-373在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平及臨床意義
　　目的:
　　測(cè)定mi

6、R-373在ESCC組織及術(shù)前血漿中的表達(dá)水平，分析miR-373的異常表達(dá)與ESCC的分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床特征的關(guān)系，探討miR-373在組織及血漿中表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　方法:
　　從2012年10月到2014年9月在山東省腫瘤醫(yī)院及泰安市中心醫(yī)院首次診斷為ESCC患者中選取63名，收集腫瘤組織、瘤旁正常組織及術(shù)前外周血，另取39例健康志愿者的外周血作為陰性對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)

7、定miR-373在ESCC腫瘤組織及瘤旁正常組織中的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)了miR-373在術(shù)前ESCC患者及健康志愿者血漿中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.miR-373在63例ESCC腫瘤組織中的表達(dá)水平要顯著高于瘤旁正常組織(P＜0.01)。miR-373在組織中的表達(dá)水平與分化程度、腫瘤T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)。
　　2.miR-373在63例ESCC術(shù)前血漿中的表達(dá)水平要顯著高于39例健康志愿

8、者(P＜0.01)。miR-373在血漿中的表達(dá)水平與腫瘤T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)。
　　3.Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析得知，miR-373在腫瘤組織中的表達(dá)水平與血漿中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.553,P＜0.01)。說(shuō)明miR-373在組織及血漿中的表達(dá)水平具有一致性。
　　結(jié)論:
　　miR-373在ESCC組織及外周血漿中的表達(dá)均顯著升高，表明miR-373作為癌基因在ESCC的發(fā)病過(guò)程

9、中發(fā)揮了重要作用。
　　第二部分 miR-373對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響
　　目的:
　　觀察miR-373表達(dá)水平的變化對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響，探討miR-373的表達(dá)與ESCC生物學(xué)特性的關(guān)系。
　　方法:
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)4種ESCC細(xì)胞系中miR-373的表達(dá)水平。選取miR-373表達(dá)水平最高的KYSE410和表達(dá)水平最低的ECA109來(lái)進(jìn)

10、行功能實(shí)驗(yàn)。將miR-373 mimics轉(zhuǎn)染到ECA109細(xì)胞中來(lái)提高miR-373的表達(dá)水平，將miR-373 inhibitor轉(zhuǎn)染到KYSE410細(xì)胞中來(lái)降低miR-373的表達(dá)水平。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估ESCC細(xì)胞的增殖能力，凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡的變化，應(yīng)用未覆蓋及覆蓋Matrigel膠的Transwell小室分別來(lái)進(jìn)行細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.miR-373表達(dá)水平的次序?yàn)镵YSE410

11、＞EC9706＞TE-1＞ECA109。選取miR-373表達(dá)水平最高的KYSE410和表達(dá)水平最低的ECA109來(lái)進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。
　　2.在ECA109細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后，miR-373 mimics組的細(xì)胞增殖能力要高于陰性對(duì)照組(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染72h后，兩者之間的區(qū)別更加明顯(P＜0.01)。在KYSE410細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后，miR-373 inhibitor組的細(xì)胞增殖能力低于陰性對(duì)照組(P＜0.05);轉(zhuǎn)染

12、72h后，兩者之間的差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這些結(jié)果顯示，miR-373可以提高ESCC細(xì)胞的增殖能力。
　　3.miR-373 mimics組凋亡細(xì)胞所占的比例與陰性對(duì)照組相比，無(wú)顯著區(qū)別(P＞0.05)。而miR-373 inhibitor組凋亡細(xì)胞的比例要高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)。因此，抑制miR-373的表達(dá)可以促進(jìn)ESCC的細(xì)胞凋亡。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-373mimics后ECA109的遷移能

13、力及侵襲能力較陰性對(duì)照組顯著提高(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor后KYSE410的遷移能力及侵襲能力較陰性對(duì)照組顯著減弱(P＜0.01)。說(shuō)明miR-373可以提高ESCC細(xì)胞的遷移及侵襲能力。
　　結(jié)論:
　　miR-373的過(guò)表達(dá)可以提高ESCC的細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。抑制miR-373的表達(dá)可以減弱ESCC的細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　第三部分 miR-373對(duì)

14、食管鱗狀細(xì)胞癌作用機(jī)制的初步研究
　　目的:
　　miRNAs雖然不編碼蛋白質(zhì)，但是可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與mRNA的3'-UTR區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯。通過(guò)生物信息學(xué)軟件，我們預(yù)測(cè)到miR-373存在多個(gè)潛在靶基因，結(jié)合在ESCC中與侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，我們選擇TIMP3來(lái)進(jìn)行下一步的研究，探索TIMP3是否為miR-373的直接靶基因來(lái)影響ESCC細(xì)胞的生物學(xué)行為。
　　方法:

15、　　檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后ESCC細(xì)胞中TIMP3蛋白表達(dá)的差異，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TIMP3是否為miR-373的直接靶基因，同時(shí)通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證TIMP3是否影響miR-373對(duì)ESCC細(xì)胞的遷移及侵襲作用。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)染miR-373 mimics后，ECA109細(xì)胞中TIMP3蛋白的相對(duì)表達(dá)量要顯著低于陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染miR-373 inhibitor后，KYSE410細(xì)胞中TIMP3蛋白的相對(duì)表達(dá)量要顯著高

16、于陰性對(duì)照組。
　　2.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，TIMP3-3'UTR-WT與miR-373 mimics共轉(zhuǎn)染到人HEK293T細(xì)胞中，其熒光值比陰性對(duì)照組下降37％，而TIMP3-WT/NC，TIMP3-Mut/NC及TIMP3-Mut/miR-373之間沒(méi)有顯著差異。
　　3.無(wú)3'-UTR區(qū)域的pcDNA3.1-TIMP3和miR-373 mimics共轉(zhuǎn)染到ECA109細(xì)胞中。pcDNA3.1-TIMP3能夠減弱miR