P53和NF-Y對PRR11-FAM33A雙向啟動子的調(diào)控作用研究.pdf

1、PRR11(Proline-rich11)及其上游鄰接基因FAM33A（Family with sequencesimilarity33，member A）是兩個最近由我們以及Nigg研究小組分別發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控的腫瘤相關(guān)新基因。兩者以獨(dú)特的“頭對頭”方式緊密排列于17q23區(qū)，組成一個典型的受雙向啟動子調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄單元。此前我們已經(jīng)對該P(yáng)RR11-FAM33A雙向啟動子進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析和鑒定，并初步將其核心區(qū)域縮

2、短定位于一80 bp的范圍內(nèi)。本研究將在這一基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域重要的順式作用元件進(jìn)行分析，并進(jìn)一步重點(diǎn)分析p53與NF-Y對PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　(1) PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域的重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析采用TFSEARCH等多種軟件，對PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析。同時，采用BLAST軟件對其序

3、列同源性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域存在典型的NF-Y、Sp1和Myb結(jié)合位點(diǎn)，且這些結(jié)合位點(diǎn)的序列在人、大鼠和小鼠等多個物種中高度保守，強(qiáng)烈提示其在PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。
　　(2) PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域的定點(diǎn)突變分析為了進(jìn)一步確認(rèn)上述生物信息學(xué)的分析結(jié)果，我們對PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域進(jìn)行了定點(diǎn)突變分析。首先，采用基因

4、定點(diǎn)突變技術(shù)，以前期構(gòu)建的啟動子熒光素酶報告基因重組體PRR11-P80和FAM33A-P80為模板，對上述發(fā)現(xiàn)的PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域包含的NF-Y、Sp1和Myb結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了一系列的定點(diǎn)突變重組體。然后，采用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)對各重組體的啟動子活性進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，與野生型的報告基因重組體PRR11-P80和FAM33A-P80相比，NF-Y、Sp1和Myb結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變重組體的啟動

5、子活性均顯著降低，這進(jìn)一步強(qiáng)烈提示NF-Y、Sp1和Myb在PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用。
　　(3) NF-Y直接調(diào)節(jié)PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉(zhuǎn)錄首先，將前期構(gòu)建的各PRR11-FAM33A雙向啟動子報告基因系列刪除體、NF-Y結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變重組體分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與NF-Y真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞，結(jié)果表明，NF-Y過表達(dá)能夠明顯提高包括PRR11-P80和FAM33A-P80在

6、內(nèi)的各個系列刪除體的活性，但NF-Y過表達(dá)對NF-Y結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變重組體的啟動子活性的上調(diào)作用受到顯著削弱甚至喪失，提示NF-Y主要通過PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域中的NF-Y結(jié)合位點(diǎn)（CCAAT盒）發(fā)揮對PRR11-FAM33A轉(zhuǎn)錄單元的直接轉(zhuǎn)錄激活作用。同時，將NF-YB siRNA轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞，定量RT-PCR分析結(jié)果表明，siRNA介導(dǎo)的NF-Y表達(dá)抑制可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性的PRR11和FAM33A mRN

7、A水平降低。另外，染色質(zhì)免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）和電泳遷移率變動分析(Electrophoretic mobolity shift assay，EMSA)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，NF-Y可以在體內(nèi)(in vivo)和體外(in vitro)結(jié)合在PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域的NF-Y結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，NF-Y可以直接調(diào)節(jié)PRR11-FAM33A雙向啟動子

8、的轉(zhuǎn)錄，PRR11和FAM33A是兩個新的NF-Y靶基因。
　　(4) p53通過NF-Y抑制PRR11和FAM33A的轉(zhuǎn)錄首先，將前期構(gòu)建的PRR11-FAM33A雙向啟動子報告基因重組體單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與野生型p53表達(dá)質(zhì)粒、突變型p53表達(dá)質(zhì)粒和NF-Y表達(dá)質(zhì)粒以不同組合共轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞。啟動子活性分析結(jié)果表明，野生型p53過表達(dá)能夠明顯抑制PRR11-FAM33A雙向啟動子的活性，而突變型p53過表達(dá)對該雙向啟動子沒有抑制作

9、用。與NF-Y轉(zhuǎn)染組相比，NF-Y和野生型p53共轉(zhuǎn)染組的啟動子活性明顯降低，表明p53可以抑制NF-Y對PRR11-FAM33A雙向啟動子的激活作用。但與野生型的報告基因重組體PRR11-P80和FAM33A-P80相比，野生型p53過表達(dá)對NF-Y結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變重組體的啟動子活性的抑制作用受到顯著削弱甚至喪失，表明p53通過NF-Y而發(fā)揮其對PRR11-FAM33A的轉(zhuǎn)錄抑制作用。同時，將NF-YB siRNA與野生型p53表達(dá)

10、質(zhì)粒單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染入H1299細(xì)胞，定量RT-PCR分析結(jié)果表明，野生型p53表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性PRR11和FAM33A mRNA水平降低，且NF-Y的表達(dá)被抑制之后，p53下調(diào)內(nèi)源性PRR11和FAM33A基因mRNA表達(dá)水平的能力明顯減弱。免疫共沉淀結(jié)果表明，p53與NF-Y在細(xì)胞內(nèi)具有相互作用并形成復(fù)合物。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外源過表達(dá)p53時，p53在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合在PRR11-FAM33A雙向啟動子區(qū)域的量明顯增加，并導(dǎo)致N

11、F-Y在雙向啟動子區(qū)的結(jié)合量顯著降低。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示，p53能夠通過與NF-Y相互作用并降低NF-Y在PRR11-FAM33A雙向啟動子區(qū)域的結(jié)合量而間接地抑制PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉(zhuǎn)錄。
　　綜上，本研究不僅發(fā)現(xiàn)了PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域含有NF-Y等重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，而且證實(shí)了NF-Y可以直接激活PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉(zhuǎn)錄，且野生型p53可通過與NF-Y相互作用而間接抑制P