P53和NF-Y對PRR11-FAM33A雙向啟動子的調控作用研究.pdf

1、PRR11(Proline-rich11)及其上游鄰接基因FAM33A（Family with sequencesimilarity33，member A）是兩個最近由我們以及Nigg研究小組分別發(fā)現(xiàn)的參與細胞增殖和細胞周期調控的腫瘤相關新基因。兩者以獨特的“頭對頭”方式緊密排列于17q23區(qū)，組成一個典型的受雙向啟動子調控的基因轉錄單元。此前我們已經對該PRR11-FAM33A雙向啟動子進行了較為系統(tǒng)的分析和鑒定，并初步將其核心區(qū)域縮

2、短定位于一80 bp的范圍內。本研究將在這一基礎上，進一步對PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域重要的順式作用元件進行分析，并進一步重點分析p53與NF-Y對PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉錄調控作用。
　　(1) PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域的重要轉錄因子結合位點分析采用TFSEARCH等多種軟件，對PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域的潛在轉錄因子結合位點進行分析。同時，采用BLAST軟件對其序

3、列同源性進行分析。結果表明，PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域存在典型的NF-Y、Sp1和Myb結合位點，且這些結合位點的序列在人、大鼠和小鼠等多個物種中高度保守，強烈提示其在PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉錄調控中起重要作用。
　　(2) PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域的定點突變分析為了進一步確認上述生物信息學的分析結果，我們對PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域進行了定點突變分析。首先，采用基因

4、定點突變技術，以前期構建的啟動子熒光素酶報告基因重組體PRR11-P80和FAM33A-P80為模板，對上述發(fā)現(xiàn)的PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域包含的NF-Y、Sp1和Myb結合位點進行定點突變，構建了一系列的定點突變重組體。然后，采用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)對各重組體的啟動子活性進行檢測。結果表明，與野生型的報告基因重組體PRR11-P80和FAM33A-P80相比，NF-Y、Sp1和Myb結合位點的定點突變重組體的啟動

5、子活性均顯著降低，這進一步強烈提示NF-Y、Sp1和Myb在PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉錄調控中起重要作用。
　　(3) NF-Y直接調節(jié)PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉錄首先，將前期構建的各PRR11-FAM33A雙向啟動子報告基因系列刪除體、NF-Y結合位點定點突變重組體分別單獨轉染或與NF-Y真核表達質粒共轉染入H1299細胞，結果表明，NF-Y過表達能夠明顯提高包括PRR11-P80和FAM33A-P80在

6、內的各個系列刪除體的活性，但NF-Y過表達對NF-Y結合位點的定點突變重組體的啟動子活性的上調作用受到顯著削弱甚至喪失，提示NF-Y主要通過PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域中的NF-Y結合位點（CCAAT盒）發(fā)揮對PRR11-FAM33A轉錄單元的直接轉錄激活作用。同時，將NF-YB siRNA轉染入H1299細胞，定量RT-PCR分析結果表明，siRNA介導的NF-Y表達抑制可導致細胞內源性的PRR11和FAM33A mRN

7、A水平降低。另外，染色質免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）和電泳遷移率變動分析(Electrophoretic mobolity shift assay，EMSA)實驗結果也證實，NF-Y可以在體內(in vivo)和體外(in vitro)結合在PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域的NF-Y結合位點。這些結果表明，NF-Y可以直接調節(jié)PRR11-FAM33A雙向啟動子

8、的轉錄，PRR11和FAM33A是兩個新的NF-Y靶基因。
　　(4) p53通過NF-Y抑制PRR11和FAM33A的轉錄首先，將前期構建的PRR11-FAM33A雙向啟動子報告基因重組體單獨轉染或與野生型p53表達質粒、突變型p53表達質粒和NF-Y表達質粒以不同組合共轉染H1299細胞。啟動子活性分析結果表明，野生型p53過表達能夠明顯抑制PRR11-FAM33A雙向啟動子的活性，而突變型p53過表達對該雙向啟動子沒有抑制作

9、用。與NF-Y轉染組相比，NF-Y和野生型p53共轉染組的啟動子活性明顯降低，表明p53可以抑制NF-Y對PRR11-FAM33A雙向啟動子的激活作用。但與野生型的報告基因重組體PRR11-P80和FAM33A-P80相比，野生型p53過表達對NF-Y結合位點的定點突變重組體的啟動子活性的抑制作用受到顯著削弱甚至喪失，表明p53通過NF-Y而發(fā)揮其對PRR11-FAM33A的轉錄抑制作用。同時，將NF-YB siRNA與野生型p53表達

10、質粒單獨或聯(lián)合轉染入H1299細胞，定量RT-PCR分析結果表明，野生型p53表達可以導致細胞內源性PRR11和FAM33A mRNA水平降低，且NF-Y的表達被抑制之后，p53下調內源性PRR11和FAM33A基因mRNA表達水平的能力明顯減弱。免疫共沉淀結果表明，p53與NF-Y在細胞內具有相互作用并形成復合物。ChIP實驗結果顯示，外源過表達p53時，p53在細胞內結合在PRR11-FAM33A雙向啟動子區(qū)域的量明顯增加，并導致N

11、F-Y在雙向啟動子區(qū)的結合量顯著降低。這些結果強烈提示，p53能夠通過與NF-Y相互作用并降低NF-Y在PRR11-FAM33A雙向啟動子區(qū)域的結合量而間接地抑制PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉錄。
　　綜上，本研究不僅發(fā)現(xiàn)了PRR11-FAM33A雙向啟動子核心區(qū)域含有NF-Y等重要的轉錄因子結合位點，而且證實了NF-Y可以直接激活PRR11-FAM33A雙向啟動子的轉錄，且野生型p53可通過與NF-Y相互作用而間接抑制P