近海副溶血弧菌和甲肝病毒檢測方法建立及沉積物細菌多樣性分析.pdf

1、海洋環(huán)境中存在著大量的病原微生物，其中既有導致海洋生物疾病的病原微生物、人類傳染病病原微生物，亦有導致人與海洋生物共患的病原微生物。這些病原微生物的存在和散播，對海水養(yǎng)殖業(yè)構成了很大威脅，同時又可通過食物鏈進入人體，導致人傳染病爆發(fā)流行。因此，開展海洋病原微生物的監(jiān)測，對于評估海產食品安全，進行疾病的早期預警預報，減少相關的經濟損失，具有重要的應用推廣價值。 本研究選定凡納濱對蝦紅體病病原菌—副溶血弧菌(Vibrioparaha

2、emolyticus)、海水中以及貝類體內的甲肝病毒、排污入?？谔幊练e物中細菌作為研究代表，從實際應用出發(fā)，初步系統(tǒng)地建立起高效、靈敏的檢測方法。并在我國首次將聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(PolymeraseChainReaction-DenaturingGradientGelElectrophoresis，PCR-DGGE)的方法應用于海洋沉積物中病原微生物多樣性的分析。 本研究通過優(yōu)勢菌分離、回歸感染實驗、生理生化特性

3、以及16SrRNA基因分析，將從患紅體病的凡納濱對蝦體內分離到的病原菌確定為副溶血弧菌。以副溶血弧菌為抗原，免疫新西蘭兔獲得高免血清，建立了檢測副溶血弧菌的三種免疫學檢測方法，分別為間接酶聯(lián)免疫吸附試驗法(IndirectEnzyme-linkedImmunosorbentAssay,iELISA)、斑點ELISA(Dot-ELISA)方法、間接熒光抗體(IndirectFluorescentAntibody,IFA)檢測方法。三種免疫

4、學檢測方法均具有較高的穩(wěn)定性和特異性；靈敏性從高到低排列依次為：IFA、iELISA、Dot-ELISA；檢測所用時間均很快速，分別為2h、9h、7h；所需儀器設備方面，Dot-ELISA方法所需儀器設備最簡單，最適于現場調查應用。另外，根據副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素(TDH)的保守閱讀框pR72H基因序列設計引物，采用熱裂解法提取副溶血弧菌的DNA，建立了PCR方法。所建立的PCR方法靈敏度較高，檢出限能夠達到90～100CFU；特異

5、性較強，能夠在2h內完成檢測。 采用吸附-洗脫的原理，建立了從海水中濃縮甲肝病毒的方法；采用氯仿去除脂蛋白、聚乙二醇濃縮的原理，建立了從貝類體內濃縮甲肝病毒的方法；在此基礎之上，建立了檢測甲肝病毒的“RT-PCR擴增—聚丙烯酰胺凝膠電泳—銀染色方法”。將該方法應用到遼東灣重點沿岸海域海水中和貝類體內甲肝病毒的檢測，檢測結果為：海水中甲肝病毒陽性檢出率為100％，貝類樣品中甲肝病毒陽性檢出率分別為57％和67％。 在我國首

6、次將PCR-DGGE方法應用于海洋沉積物中病原微生物多樣性的分析，并將該方法初步應用于大連市重點排污入?？谔幊练e物中細菌多樣性分析，旨在分析生活污水以及醫(yī)院廢水等近海排放導致的海洋污染情況。建立了從海洋沉積物中提取細菌總DNA的方法，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測結果表明，所提取的核酸濃度和純度均較好。對所采集的8個站位樣品DNA進行16SrRNA基因V3區(qū)的PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，各樣品擴增條帶均在220bp左右。進一步

7、應用DGGE電泳分析，結果表明，各樣品的細菌多樣性豐富。從DGGE電泳圖譜中選取了22個具有代表性條帶進行回收測序，再與Genbank上的細菌核酸序列進行Blast分析，在此基礎上構建了系統(tǒng)發(fā)生樹。結果表明，有21/22個樣品與已知細菌序列的同源性均在83％以上，最高達98％，其中有2個樣品為不可培養(yǎng)的未命名細菌。22個測序樣品分析結果顯示，所采集樣品中含有豬鏈球菌、梅毒螺旋體、鼻疽奴卡菌等能使人致病的細菌，其余為非細菌。 本實

8、驗建立的副溶血弧菌免疫學及分子生物學檢測方法，可以用于凡納濱對蝦紅體病病原菌—副溶血弧菌的早期監(jiān)測，為凡納濱對蝦紅體病早期預防起到指導作用，同時為保證公眾食品安全提供檢測手段。建立的甲肝病毒RT-PCR檢測方法，可以應用于檢驗檢疫、水產品質量安全檢測等，為人類在海洋中活動及食用海產品的安全性監(jiān)測提供技術支持。另外，本研究在我國首次建立分析海洋沉積物中細菌多樣性的PCR-DGGE方法，并用于分析排污入?？谔幊练e物中細菌的多樣性，從而了解近

9、海排污給人體健康帶來的潛在威脅，將在一定程度上提高海洋環(huán)境生態(tài)監(jiān)測的科學水平。 本研究針對幾種典型海洋病原微生物所建立的免疫學、分子生物學等檢測方法，穩(wěn)定性及特異性良好，敏感性及耗時各有不同，可以根據具體實驗條件、研究內容的差異，選擇不同的檢測方法。這些方法在我國海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測部門海洋病原微生物的調查和監(jiān)測中有很好的應用潛力及前景，并為研制和生產海洋病原微生物快速檢測試劑盒提供急需的關鍵技術，因而在推動我國海洋生態(tài)環(huán)境調查監(jiān)