近海副溶血弧菌和甲肝病毒檢測方法建立及沉積物細菌多樣性分析.pdf

1、海洋環(huán)境中存在著大量的病原微生物，其中既有導(dǎo)致海洋生物疾病的病原微生物、人類傳染病病原微生物，亦有導(dǎo)致人與海洋生物共患的病原微生物。這些病原微生物的存在和散播，對海水養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了很大威脅，同時又可通過食物鏈進入人體，導(dǎo)致人傳染病爆發(fā)流行。因此，開展海洋病原微生物的監(jiān)測，對于評估海產(chǎn)食品安全，進行疾病的早期預(yù)警預(yù)報，減少相關(guān)的經(jīng)濟損失，具有重要的應(yīng)用推廣價值。 本研究選定凡納濱對蝦紅體病病原菌—副溶血弧菌(Vibrioparaha

2、emolyticus)、海水中以及貝類體內(nèi)的甲肝病毒、排污入?？谔幊练e物中細菌作為研究代表，從實際應(yīng)用出發(fā)，初步系統(tǒng)地建立起高效、靈敏的檢測方法。并在我國首次將聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PolymeraseChainReaction-DenaturingGradientGelElectrophoresis，PCR-DGGE)的方法應(yīng)用于海洋沉積物中病原微生物多樣性的分析。 本研究通過優(yōu)勢菌分離、回歸感染實驗、生理生化特性

3、以及16SrRNA基因分析，將從患紅體病的凡納濱對蝦體內(nèi)分離到的病原菌確定為副溶血弧菌。以副溶血弧菌為抗原，免疫新西蘭兔獲得高免血清，建立了檢測副溶血弧菌的三種免疫學(xué)檢測方法，分別為間接酶聯(lián)免疫吸附試驗法(IndirectEnzyme-linkedImmunosorbentAssay,iELISA)、斑點ELISA(Dot-ELISA)方法、間接熒光抗體(IndirectFluorescentAntibody,IFA)檢測方法。三種免疫

4、學(xué)檢測方法均具有較高的穩(wěn)定性和特異性；靈敏性從高到低排列依次為：IFA、iELISA、Dot-ELISA；檢測所用時間均很快速，分別為2h、9h、7h；所需儀器設(shè)備方面，Dot-ELISA方法所需儀器設(shè)備最簡單，最適于現(xiàn)場調(diào)查應(yīng)用。另外，根據(jù)副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素(TDH)的保守閱讀框pR72H基因序列設(shè)計引物，采用熱裂解法提取副溶血弧菌的DNA，建立了PCR方法。所建立的PCR方法靈敏度較高，檢出限能夠達到90～100CFU；特異

5、性較強，能夠在2h內(nèi)完成檢測。 采用吸附-洗脫的原理，建立了從海水中濃縮甲肝病毒的方法；采用氯仿去除脂蛋白、聚乙二醇濃縮的原理，建立了從貝類體內(nèi)濃縮甲肝病毒的方法；在此基礎(chǔ)之上，建立了檢測甲肝病毒的“RT-PCR擴增—聚丙烯酰胺凝膠電泳—銀染色方法”。將該方法應(yīng)用到遼東灣重點沿岸海域海水中和貝類體內(nèi)甲肝病毒的檢測，檢測結(jié)果為：海水中甲肝病毒陽性檢出率為100％，貝類樣品中甲肝病毒陽性檢出率分別為57％和67％。 在我國首

6、次將PCR-DGGE方法應(yīng)用于海洋沉積物中病原微生物多樣性的分析，并將該方法初步應(yīng)用于大連市重點排污入?？谔幊练e物中細菌多樣性分析，旨在分析生活污水以及醫(yī)院廢水等近海排放導(dǎo)致的海洋污染情況。建立了從海洋沉積物中提取細菌總DNA的方法，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測結(jié)果表明，所提取的核酸濃度和純度均較好。對所采集的8個站位樣品DNA進行16SrRNA基因V3區(qū)的PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，各樣品擴增條帶均在220bp左右。進一步

7、應(yīng)用DGGE電泳分析，結(jié)果表明，各樣品的細菌多樣性豐富。從DGGE電泳圖譜中選取了22個具有代表性條帶進行回收測序，再與Genbank上的細菌核酸序列進行Blast分析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果表明，有21/22個樣品與已知細菌序列的同源性均在83％以上，最高達98％，其中有2個樣品為不可培養(yǎng)的未命名細菌。22個測序樣品分析結(jié)果顯示，所采集樣品中含有豬鏈球菌、梅毒螺旋體、鼻疽奴卡菌等能使人致病的細菌，其余為非細菌。 本實

8、驗建立的副溶血弧菌免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢測方法，可以用于凡納濱對蝦紅體病病原菌—副溶血弧菌的早期監(jiān)測，為凡納濱對蝦紅體病早期預(yù)防起到指導(dǎo)作用，同時為保證公眾食品安全提供檢測手段。建立的甲肝病毒RT-PCR檢測方法，可以應(yīng)用于檢驗檢疫、水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測等，為人類在海洋中活動及食用海產(chǎn)品的安全性監(jiān)測提供技術(shù)支持。另外，本研究在我國首次建立分析海洋沉積物中細菌多樣性的PCR-DGGE方法，并用于分析排污入海口處沉積物中細菌的多樣性，從而了解近

9、海排污給人體健康帶來的潛在威脅，將在一定程度上提高海洋環(huán)境生態(tài)監(jiān)測的科學(xué)水平。 本研究針對幾種典型海洋病原微生物所建立的免疫學(xué)、分子生物學(xué)等檢測方法，穩(wěn)定性及特異性良好，敏感性及耗時各有不同，可以根據(jù)具體實驗條件、研究內(nèi)容的差異，選擇不同的檢測方法。這些方法在我國海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測部門海洋病原微生物的調(diào)查和監(jiān)測中有很好的應(yīng)用潛力及前景，并為研制和生產(chǎn)海洋病原微生物快速檢測試劑盒提供急需的關(guān)鍵技術(shù)，因而在推動我國海洋生態(tài)環(huán)境調(diào)查監(jiān)