副溶血弧菌及其相關毒力因子檢測方法的建立.pdf

1、弧菌(Vibrio)是自然物種多樣化的細菌，主要棲息于水體和水生動物中。分離到的弧菌中有70％以上是霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌，這些弧菌不僅對動物有致病性，還對人類健康有很大的威脅。被霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌感染的主要原因是吃了被污染的海產品和傷口暴露于水環(huán)境。其中副溶血弧菌是引起食源性細菌胃腸炎的最主要原因，主要的毒力因子是耐熱直接溶血素(TDH)和耐熱相關溶血素（TRH）。
　　根據(jù)霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌gr

2、oEL基因序列設計三對引物分別為groVc、groVp和groVv，建立同時檢測三種弧菌多重PCR方法，經過對反應體系的優(yōu)化，獲得最佳反應體系為(25μL):PCR Mix10μL，上下游引物(10pmM)各0.5μL，模板2μL，用ddH2O調整終體積至25μL。反應條件為94℃預變性4min;94℃變性30s;退火溫度66℃，退火時間30s;72℃延伸30s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。檢測結果表明該檢測方法具有較高的特異

3、性，對目標菌株DNA的檢測靈敏度分別為霍亂弧菌1ng/μL，副溶血弧菌1ng/μL，創(chuàng)傷弧菌1ng/μL。該方法能同時檢測到三種弧菌，為開展霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌感染的調查提供了技術手段。
　　以副溶血弧菌的toxR基因、耐熱直接溶血素(TDH)基因和耐熱相關溶血素(TRH)基因為靶基因設計三對引物，建立檢測副溶血弧菌主要毒力因子的多重PCR檢測方法。經過對反應體系的優(yōu)化，獲得最佳反應體系為(25μL): PCR Mix1

4、0μL，上下游引物（10pmM）量為trh各2μL，tdh各0.5μL; toxR各0.5μL，模板2μL，用ddH2O調整終體積至25μL。反應條件為94℃預變性4min;94℃變性，45s;退火溫度60℃，退火時間45s;72℃延伸1min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。toxR、trh、tdh三對引物檢測到的副溶血弧菌的最低濃度分別是1×10-2 ng/μL，0.1ng/μL，0.1ng/μL。特異性的檢測及人工布菌試驗

5、，結果表明設計的引物具有較強的特異性。本方法可以作為一種快速檢測致病性副溶血弧菌的方法。
　　本試驗以直接耐熱溶血素(TDH)為抗原建立了檢測副溶血弧菌的Dot-ELISA方法，血清抗體由本實驗室研制，通過多次優(yōu)化，確定最佳反應條件為加樣的PVDF膜在20％的脫脂乳中封閉1h，與1∶100的血清抗體反應30min，與1∶1000的HRP-羊抗兔IgG反應1h，血清稀釋液和洗滌液均為PBST。通過特異性及靈敏度的檢測，表明該方法操作