抑制TRPC3-6表達減輕糖尿病心肌纖維化的實驗研究.pdf

1、背景：
　　2011年中國因糖尿病(diabetes mellitus，DM)死亡的人數(shù)多達113萬，其中繼發(fā)于糖尿病的心臟并發(fā)癥已成為糖尿病患者死亡的主要原因（超過70％）。其中糖尿病心肌病(Diabetes cardiomyopathy,DCM)發(fā)病率高，預后差，極大影響生活質量。與非糖尿病性心臟病相比糖尿病心肌病發(fā)病早，但癥狀通常較為隱蔽，多表現(xiàn)為無痛性心肌梗死，且梗死面積相對較大，易穿壁，其與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率

2、和高病死率密切相關。該病患者多數(shù)處于亞臨床期，在此期間主要病理改變?yōu)樾募〖毎蚀蠛托募±w維化，之后隨病情進展逐漸發(fā)生心臟收縮功能異常。糖尿病心肌病發(fā)病機制復雜，目前具體機制尚未被完全闡明。國內外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典瞬時受體電位通道(transient receptor potential channel，TRPC)過表達在糖尿病神經(jīng)病變中神經(jīng)元凋亡，糖尿病腎病中足細胞功能損傷和肺動脈高壓等過程中發(fā)揮了重要作用，而抑制TRPC的表達對于延緩神經(jīng)

3、元凋亡、修復足細胞功能、緩解肺動脈高壓有著較為確切的效果。本實驗通過TRPC3/6通道阻滯劑SKF96365下調TRPC3/6在心肌細胞中的表達，并檢測心肌纖維化的相關指標，探討TRPC阻滯劑對于糖尿病心肌纖維化的改善作用。
　　方法：
　　實驗分組:SPF級雄性Wistar大鼠30只，隨機分為A組（空白對照組）、B組（糖尿病對照組）和C組（糖尿病+TRPC阻滯劑干預組），其中B組、C組為Ⅱ型糖尿病大鼠。
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4、病大鼠模型制備方法如下:4周齡大鼠適應環(huán)境1周后、A組予正常飲食，B組、C組予高糖高脂飲食（脂肪熱量百分比60％，碳水化合物（蔗糖）熱量百分比22％，蛋白質熱量百分比18％，總熱量約為5.5千卡/克）8周。禁食24小時后B組、C組腹腔注射1％鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)35mg/Kg，A組注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。24小時及48小時后檢測指標，以空腹血糖＞11.1mmol/L,餐后血糖＞16.7mmol/L,糖化

5、血紅蛋白＞6％，尿糖定性（+++）以上，且出現(xiàn)多飲多食現(xiàn)象為造模成功者。若不成功，首次腹腔注射72小時后再次禁食24小時，腹腔注射STZ17.5mg/kg，24小時后復查各項指標，成模標準同上。
　　實驗流程:之后C組予0.74μmol/kgSKF96365每日一次腹腔注射。A組、B組予等量生理鹽水腹腔注射。期間A組普通飲食，B組、C組繼續(xù)高糖高脂飲食，監(jiān)測體重、血糖。12周后處死取材，測定全心重、左心室重量，計算心臟比例，左心室

6、比例;HE染色觀察心肌纖維、核的分布、排列等;Masson染色觀察并鑒別膠原纖維和肌纖維，計算心肌組織膠原纖維容積分數(shù)(CVF);RT-PCR法擴增TRPC3mRNA、TRPC6mRNA產(chǎn)物后通過瓊脂糖凝膠電泳法測定其含量。
　　數(shù)據(jù)處理:全部結果以SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差的形式表示。各組間實驗數(shù)據(jù)首選單因素方差分析，先進行方差齊性檢驗，若方差齊則采用最小顯著性差異法（LSD法），若方差不齊

7、則采用秩和檢驗或person相關分析。若p＜0.05則說明組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　相比于A組，B組、C組大鼠體重下降，血糖上升，全心重，左室重上升，其差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，但B組、C組之間體重無明顯差異(p＞0.05);HE染色見B、C組心肌細胞排列欠規(guī)則，嚴重者可見局灶性壞死、C組相對B組程度較輕;Masson染色見B組、C組心肌膠原容積分數(shù)(CVF)升高，其中B＞C(p＜0.05);RT-P

8、CR及瓊脂糖凝膠電泳結果提示B組、C組TRPC3mRNA和TRPC6mRNA相對A組表達上調，且B＞C(p＜0.05)。
　　結論：
　　糖尿病心肌病的發(fā)病機制可能與TRPC3和TRPC6的過表達有關:TRPC3、TRPC6過表達可上調心肌細胞膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、肌動蛋白等的表達，使其沉積增多，導致心肌細胞肥大和纖維化，進而引起DCM的發(fā)生。抑制TRPC3、TRPC6表達可減輕心肌纖維化病變程度。通過該項研究探究了TRP