花生四烯酸細胞色素P450表氧化酶促進人類腫瘤轉移.pdf

1、目的與意義 花生四烯酸(arachdonicacid，AA)是生物體內最豐富的物質之一，是體內多種重要活性物質的來源，主要是以酯化的形式結合在細胞膜內側的脂肪酸上，在脂解激素刺激時由磷脂酶A2水解釋放至細胞漿內。對AA的研究已有多年，最為人們熟知的是環(huán)氧化酶和脂質氧化酶代謝途徑，近年研究發(fā)現(xiàn)AA還可通過細胞色素P450途徑代謝(即AA代謝的第三條途徑)，包括花生四烯酸細胞色素P450表氧化酶(AAcytochromeP450ep

2、oxygenase，CYP)途徑和ω-羥化酶途徑，其中AA經(jīng)表氧化酶代謝產生四種EETs(5，6-，8,9-，11，12-和14,15-EET)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在哺乳動物有14個家族和26個亞族，而在人類僅發(fā)現(xiàn)有CYP2C和CYP2J表達。CYP在體內廣泛分布，尤其在肝臟中表達最豐富，主要存在于內質網(wǎng)和線粒體，在血管中亦存在表達；目前已發(fā)現(xiàn)并克隆2J家族的9個基因，其中在人類僅發(fā)現(xiàn)了2J2，其在心臟和血管內皮細胞表達最豐富，我們和國外學者已經(jīng)

3、發(fā)現(xiàn)EETs在調節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，EETs可以通過激活鈣離子敏感的鉀通道，使平滑肌細胞處于超極化狀態(tài)而擴張血管調節(jié)血壓，還參與調節(jié)炎癥、細胞遷移、細胞凋亡、血小板聚集和保護內皮細胞。 我們的研究首次證實表氧化酶基因在不同的人類腫瘤組織中以及腫瘤細胞系中選擇性高表達。研究發(fā)現(xiàn)轉染CYP2J2和外源性EETs通過激活MAPK、PI3K/AKt、及EGFR途徑促進腫瘤的惡性增殖；通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x

4、L、下調凋亡蛋白Bax來保護腫瘤細胞凋亡。這些結果表明CYP2J2在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。然而CYP和EETs在人類腫瘤轉移中的作用及其機制如何，花生四烯酸表氧化酶抑制劑在腫瘤的防治中有何意義呢? 本研究通過對雌激素受體陰性、高轉移的乳腺癌細胞(MDA-MB-435s)給予重組腺相關病毒(recombinantadeno-associatedvirus，rAAV)介導的表氧化酶基因轉染，探討其對腫瘤轉移的影響以及

5、相關機制；試驗了花生四烯酸表氧化酶抑制劑(17-ODYA)對裸鼠移植瘤的抑瘤效應。 方法與結果 1.培養(yǎng)MDA-MB-435s細胞，通過重組腺相關病毒介導的正義和反義CYP2J2轉染，主要進行以下研究 1.1CYP2J2對MDA-MB-435s細胞增殖的影響：腫瘤是由于致瘤因素的作用，局部組織的細胞失去了對其正常生長的調控，導致異常克隆性增生。正常細胞生長依賴錨泊，有密度依賴抑制或接觸抑制，腫瘤細胞則缺乏這種生長

6、限制，甚至可在半固體瓊脂中呈懸浮生長，不需要依附固定表面，不受密度限制，可持續(xù)分裂堆積生長。瓊軟脂克隆形成又叫錨泊不依賴生長，通過計數(shù)2-4周后軟瓊脂上的克隆數(shù)目來檢測細胞的增殖能力，細胞在這種半固態(tài)媒體上生長是表型改變的指標之一，也是證明促有絲分裂能力的方法之一。因此我們利用軟瓊脂克隆形成試驗來觀察CYP2J2轉染后在軟瓊脂上形成克隆的能力。結果反義2J2轉染明顯抑制MDA-MB-435s在軟瓊脂上形成克隆的能力，與GFP組(10.7

7、5±2.753)和空白對照組(11.75±2.217)比較，反義2J2轉染組(3.25±2.217)形成的克隆數(shù)目少，直徑小；CYP2J2(19±3.7416)轉染則顯著促進MDA-MB-435s細胞在軟瓊脂上形成克隆，且克隆較對照組和轉染GFP組明顯增大，而且數(shù)目多。 1.2CYP2J2對MDA-MB-435s細胞黏附于細胞外基質的影響：腫瘤的浸潤過程首先是腫瘤細胞黏附并降解細胞外基質，然后遷移穿過細胞外基質。我們選取細胞外基

8、質主要成分之一纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)來研究表氧化酶及其產物對腫瘤細胞黏附的影響。結果表明，與對照組比較，轉染反義CYP2J2顯著抑制MDA-MB-435s細胞黏附于基質成分黏附細胞數(shù)約是對照組的50％，而轉染CYP2J2使其過表達表氧化酶則顯著促進MDA-MB-435s細胞黏附(P＜0.05)。用表氧化酶代謝花生四烯酸產物EETs預處理MDA-MB-435s半小時也顯著的促進MDA-MB-435s細胞黏附，而表氧化

9、酶抑制劑能顯著抑制MDA-MB-435s細胞的黏附(P＜0.01)。 1.3CYP2J2對MDA_MB-435s細胞游走遷移的影響：細胞的游走遷移是腫瘤浸潤轉移的一個重要步驟。我們利用改良的Boyden趨化小室研究CYP2J2對MDA-MB-435s細胞游走遷移的影響。實驗結果顯示轉染反義CYP2J2的MDA-MB-435s細胞穿過多聚碳酸酯膜的細胞數(shù)下降49％，而轉染正義CYP2J2的細胞穿過多聚碳酸酯膜的細胞數(shù)幾乎為對照組的

10、兩倍，外源性應用表氧化酶抑制劑(17-ODYA)明顯抑制MDA-MB-435s細胞的遷移，而三種EETs顯著促進MDA-MB-435s細胞遷移。 1.4CYP2J2對腫瘤轉移影響的在體實驗研究及其可能機制：為了觀察表氧化酶基因2J2是否影響腫瘤的在體轉移能力，我們用rAAV-2J2、rAAV-anti2J2和rAAV-GFP感染MDA-MB-435s細胞，3天后接種至雌性裸鼠腋窩皮下，觀察腫瘤生長情況。12周后處死裸小鼠，bou

11、in'ssolution固定肺組織，觀察比較肺部轉移瘤結節(jié)數(shù)目。結果顯示CYP2J2轉染后的腫瘤細胞在體內生長迅速，腫瘤結節(jié)出現(xiàn)的平均時間明顯提前，瘤結節(jié)體積與對照組比較體積明顯增大；轉染反義CYP2J2的腫瘤細胞在體生長緩慢，腫瘤結節(jié)出現(xiàn)時間延遲，平均瘤結節(jié)體積比對照組明顯減小，其中有三只在12周末仍然沒有長出可以目測的移植瘤，與對照組比較差別有顯著性意義(P＜0.05)。接著我們觀察了腫瘤在肺部的轉移情況，結果發(fā)現(xiàn)CYP2J2顯著促

12、進了腫瘤的肺轉移，肺組織表面肉眼能見的瘤結節(jié)數(shù)目為對照組的2.8倍，反義CYP2J2組則沒有觀察到明顯的肺轉移。以上結果顯示CYP2J2具有促惡性腫瘤轉移的作用。 在此基礎上，我們研究了CYP2J2和EETs促進腫瘤轉移的可能機制，用Westernblot方法檢測EETs干預和表氧化酶基因轉染對轉移相關基因表達的影響，同時還用GelatinZymography方法檢測了CYP2J2對MMPs分泌的影響。結果發(fā)現(xiàn)CYP2J2促進M

13、MP-2的分泌；反義CYP2J2則抑制MMP-2的分泌；EETs和CYP2J2明顯上調CD44的表達，下調nm23和CD82/KAI的表達，反義CYP2J2或CYP抑制劑則顯著下調CD44的表達，上調nm23和CD82/KAI的表達。 2.花生四烯酸表氧化酶抑制劑(17-ODYA)對人舌鱗癌裸鼠移植瘤抑瘤效應的實驗研究 將人舌鱗癌細胞系(Tca8113)接種至BALB/c(nu/nu)裸鼠，建立人舌鱗癌裸鼠移植瘤模型，設

14、立陰性對照組(N.S)、陽性對照組(5-FU30mg/kg)、低劑量抑制劑組(0.5mg/只)、高劑量抑制劑組(1mg/只)和聯(lián)合用藥組(0.5mg/只17-ODYA+30mg/kg5-FU)，觀察腫瘤的生長狀態(tài)，計算抑瘤率；觀察移植瘤的組織病理學及超微結構改變。結果與陰性對照組比較，花生四烯酸表氧化酶抑制劑(17-ODYA)組裸鼠皮下移植瘤體積明顯縮小(P＜0.01)，移植瘤的生長明顯受到抑制；高劑量組平均腫瘤體積與低劑量組比較，抑制

15、作用更明顯，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義；17-ODYA組與陽性對照組相比，高劑量抑制劑組腫瘤平均體積減小不如陽性對照組明顯，但兩組之間無統(tǒng)計學差異；聯(lián)合用藥組與其他組相比腫瘤明顯受到抑制(P＜0.01)。瘤結節(jié)的重量比較與瘤結節(jié)體積結果一致。 結論： 我們的研究結果顯示①CYP2J2及其代謝花生四烯酸的下游產物EETs在促進腫瘤的惡性增殖、促進腫瘤細胞與細胞外基質的黏附以及促進腫瘤細胞游走運動能力等多個環(huán)節(jié)促進惡性腫瘤轉

16、移，同時還可能與促進MMPs的分泌、上調轉移相關基因CD44的表達、下調轉移抑制基因CD82/KAI和nm23的表達有關。 ②花生四烯酸細胞色素P450表氧化酶抑制劑(17-ODYA)對人舌鱗癌裸鼠移植瘤有明顯的抑瘤效應，但是其作用機制、毒副作用以及與其他臨床化療藥物聯(lián)合的療效尚需進一步的研究?？傊@些發(fā)現(xiàn)為惡性腫瘤的基因治療提供了新的靶點，為開發(fā)新的抗癌藥物提供了理論基礎。但是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素多步驟的過程，CY