外源性線粒體抗組織老化作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:1.通過檢測(cè)正常衰老的C57BL/6小鼠肺組織、氣道上皮細(xì)胞和人工下調(diào)細(xì)胞色素C氧化酶（COX）活性的C57BL/6小鼠肺組織、氣道上皮細(xì)胞的：線粒體DNA（mtDNA）突變率、COX活性、線粒體功能、活性氧水平、細(xì)胞功能，探索mtDNA突變率、COX活性、線粒體功能、活性氧與細(xì)胞老化之間的關(guān)系。
　　2.用外源性線粒體處理老年動(dòng)物及老年細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)老化指標(biāo)和功能指標(biāo)，以確定外源性線粒體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后是否發(fā)揮抗衰老作用。

2、>　　方法:1.從青年（1月齡）和老年（12月齡）C57BL/6小鼠肺組織提取青年線粒體（青Y mito）和老年（O mito）線粒體，純化后重懸于PBS以滴鼻方式處理青年和老年C57 BL/6小鼠，檢測(cè)指標(biāo)：肺組織線粒體COX活性、肺組織線粒體DNA（mtDNA）突變率、肺組織激活型半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（cleaved caspase-3）含量、肺組織丙二醛（MDA）含量、氣道纖毛擺動(dòng)頻率（CBF）、肺組織線粒體懸液ATP

3、含量、肺組織線粒體呼吸控制率（RCR）。
　　2.從青年（1月齡）和老年（12月齡）C57BL/6小鼠肺組織提取青年線粒體和老年線粒體純化后，線粒體懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)液共培養(yǎng)24小時(shí)后檢測(cè)指標(biāo)：細(xì)胞線粒體COX活性、細(xì)胞纖毛擺動(dòng)頻率（CBF）、線粒體懸液ATP含量、線粒體呼吸控制率（RCR）、NAD/NADH、鈣信號(hào)（[Ca2+]i）、ROS。
　　3.慢病毒感染C57 BL/6小鼠，下調(diào)COX蛋白表達(dá)，檢測(cè)COX活性和CBF

4、、ATP、RCR等功能指標(biāo)；外源性線粒體處理后再檢測(cè)COX活性和CBF、ATP、RCR等功能指標(biāo)。
　　4.在原代 C57 BL/6小鼠氣道上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)入COX干擾質(zhì)粒后，下調(diào)COX蛋白表達(dá)，檢測(cè)COX活性和CBF、ATP、RCR等功能指標(biāo)，外源性線粒體處理后再檢測(cè)COX活性和CBF、ATP、RCR等功能指標(biāo)。
　　結(jié)果:1.老年鼠肺組織mtDNA突變率、COX活性、Caspase-3含量、MDA含量明顯高于青年鼠，CBF、

5、ATP含量、RCR均低于青年鼠；以外源性線粒體處理后其突變率、Caspase-3含量、MDA含量均顯著下降，CFB、ATP含量、RCR均顯著提高。
　　2.老年細(xì)胞CBF于細(xì)胞長(zhǎng)出后第6天開始下降，第9天降至最低值，持續(xù)至12天細(xì)胞開始死亡。于第9天加入外源性線粒體共培養(yǎng)，24小時(shí)后細(xì)胞CBF開始回升，直至第12天，細(xì)胞未死亡。相比青年細(xì)胞，老化細(xì)胞線粒體COX活性、ATP含量、RCR、NAD/N ADH均下降，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]

6、I含量、ROS水平上升；外源性線粒體共培養(yǎng)24小時(shí)后，ATP含量、RCR、NAD/N ADH顯著上升，細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]I含量、ROS水平下降。
　　3.包被COX干擾質(zhì)粒的慢病毒感染后C57 BL/6小鼠肺組織線粒體COX活性、CBF、ATP、RCR等指標(biāo)均顯著下降；之后用外源性線粒體處理，COX活性回升，CBF、ATP、RCR等指標(biāo)也顯著回升。
　　4.轉(zhuǎn)入COX干擾質(zhì)粒后，原代C57 BL/6小鼠氣道上皮細(xì)胞線粒體CO

7、X活性和CBF、ATP、RCR等指標(biāo)均顯著下降，胞漿[Ca2+]I含量、ROS水平上升；之后用外源性線粒體共培養(yǎng)，COX活性和CBF、ATP、RCR等指標(biāo)顯著回升胞漿[Ca2+]I含量、ROS水平下降。
　　結(jié)論:1.老年動(dòng)物及細(xì)胞ROS含量上升，線粒體mtDNA突變率增高導(dǎo)致mtDNA編碼的COX蛋白活性下降，直接影響線粒體呼吸功能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞各項(xiàng)功能下降、老化。
　　2.以外源性線粒體滴鼻處理C57BL/6小鼠，及外源