激活SHH通路對(duì)急性腦缺血大鼠突觸再生的影響.pdf

1、背景和目的：
　　隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及生活方式的轉(zhuǎn)變，腦血管病的發(fā)生率每年都在上升，而且愈來(lái)愈趨于年輕化，不光是給社會(huì)和家庭帶來(lái)了繁重的負(fù)擔(dān)，同時(shí)也給病人帶來(lái)了心理上的包袱。缺血性腦血管病是腦血管病最常見(jiàn)的一種類型，其致殘率、致死率、致畸率極高，其重在早期診斷、早期積極治療、加強(qiáng)康復(fù)鍛煉和防止再?gòu)?fù)發(fā)。隨著對(duì)神經(jīng)修復(fù)學(xué)的不斷研究，神經(jīng)再生尤其是突觸再生對(duì)缺血性腦血管病有著重要意義。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與缺血性腦血管病的

2、相關(guān)表現(xiàn)在突觸再生方面。
　　Shh信號(hào)通路主要包括Shh信號(hào)肽，膜因子Ptch、Smo，下游轉(zhuǎn)錄因子Gli三部分，這些成分的逐級(jí)信息傳遞，或者其中因子的突變，都可活化誘導(dǎo)這一途徑，最后通過(guò)Gli作用于下游靶基因。Shh信號(hào)通路激活對(duì)腦缺血有保護(hù)作用，可以促進(jìn)突觸的再生和重建，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制作大鼠永久性缺血模型，在缺血半暗帶區(qū)觀察Sonic Hedgehog信號(hào)通路的特異性激活劑Purmorphami

3、ne分別在不同時(shí)間點(diǎn)通路下游分子Gli1的表達(dá)和突觸形成相關(guān)蛋白因子SYN、GAP-43的表達(dá)，進(jìn)一步探討Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)大腦缺血皮質(zhì)區(qū)突觸再生的影響及其機(jī)制。
　　材料和方法：
　　選用改良后的線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血（Permanent Middle Cerebral Aretery Occlusion，PMCAO)模型。健康雄性的76只SD大鼠(重大約為280～330g)，按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，

4、模型組和藥物組，其中假手術(shù)組12只，模型組和藥物組每組各32只，模型組和藥物組根據(jù)缺血時(shí)間6h，24h，72h，7d分四個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只大鼠。模型制作成功后腹腔注射0.69mg/kg的Purmorphamine為藥物組(Purmorphamine粉劑使用前需二甲基酰胺完全溶解)，假手術(shù)組和模型組于術(shù)后以同樣的方式給予等劑量的二甲基酰胺(DMF)溶液注射。按大鼠大腦缺血時(shí)間點(diǎn)6h、24h、72h、7d分別采用兩種方法取腦，其中4只深度

5、麻醉處死后1min內(nèi)取缺血大腦皮質(zhì)區(qū)腦組織，立即投液氮罐中速凍，然后置于-80度冰箱保存，用以檢測(cè)Gli1mRNA的含量;另取4只大鼠采用生理鹽水和甲醛心臟灌注，大腦組織甲醛浸泡固定后，脫水、透明、浸蠟后，石蠟包埋，取缺血大鼠大腦皮質(zhì)頂葉區(qū)行腦組織切片。
　　結(jié)果：
　　1.缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)SYN的測(cè)定結(jié)果
　　大腦皮層頂葉梗死周圍區(qū)可見(jiàn)SYN免疫反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，分布密集，有的連接呈線狀為樹突脊，正常高表達(dá)，缺血時(shí)表

6、達(dá)減低。缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)灰度值在6h開始降低，72h降低最為顯著，7d后開始上升，與假手術(shù)組相比各時(shí)間點(diǎn)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。藥物組在缺血后6h、24h、72h、7d時(shí)SYN的表達(dá)明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)GAP-43的測(cè)定結(jié)果
　　大腦皮質(zhì)頂葉缺血區(qū)可見(jiàn)GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物為小點(diǎn)狀或細(xì)顆粒狀沉積，此為GAP-43陽(yáng)性表達(dá)。其中缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)GAP-43的

7、免疫活性在缺血后6h表達(dá)量開始有所上升，72h升高最為顯著，7d后開始下降，與假手術(shù)組相比較差別有顯著意義(P＜0.05);藥物組大腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)GAP-43在6h、24h、72h、7d免疫活性明顯高于模型組，差別有顯著意義(P＜0.05)。
　　3.缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)SYNmRNA、GAP-43mRNA、Gli1mRNA的表達(dá)
　　半定量RT-PCR模型組SYNmRNA表達(dá)在6h開始逐漸降低，72h降低最為顯著，7d后開始上升，

8、與假手術(shù)組相比各時(shí)間點(diǎn)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。藥物組在缺血后6h、24h、72h、7d時(shí)SYNmRNA的表達(dá)明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)GAP-43mRNA在缺血后6h表達(dá)量逐漸開始上升，72h升高最為顯著，7d后開始下降，與假手術(shù)組相比較差別有顯著意義(P＜0.05);藥物組大腦皮質(zhì)GAP-43mRNA在6h、24h、72h、7d表達(dá)量明顯高于模型組，差別有顯著意義(P＜0.

9、05)。與假手術(shù)組比較，模型組和藥物組Gli1mRNA表達(dá)均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);模型組大腦皮質(zhì)缺血區(qū)Gli1mRNA于6h后逐漸開始升高，24h達(dá)高峰，之后有所下降但維持在較高水平。藥物組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Gli1mRNA與模型組相比較表達(dá)量顯著增高，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)給予外源性Shh通路特異性激活劑Purmorphamine能激活下游分子Gli1的表達(dá)。