克羅卡林對急性腦缺血再灌注大鼠MG、iNOS的影響.pdf

1、背目的
　　 急性腦梗死是腦血管疾病( cerebrovascular disease，CVD)的最常見類型，約占CVD的70％。腦缺血再灌注是腦缺血缺氧后重新恢復血流的過程，是臨床上常見的病理生理現(xiàn)象。缺血再灌注對恢復半暗帶區(qū)域(Ischemic Penumbra，IP)腦組織的血液供應以及功能改善有重要作用，但缺血再灌注也對腦組織造成一定損傷。
　　 在腦缺血再灌注損傷的過程中，過度炎癥免疫反應引起的病理損傷是重要的

2、損傷機制之一。小膠質細胞( microglia，MG)是腦內的主要免疫效應細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理過程中起重要作用。小膠質細胞對顱內的內環(huán)境改變及其敏感，當腦內環(huán)境發(fā)生改變時，小膠質細胞迅速激活，產生大量的神經(jīng)毒性因子，對神經(jīng)元產生毒性作用，加重對腦部的損害。誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是人體內一種重要的合酶，在腦缺血再灌注損傷時誘導合成表達，使鈉離子大量內流，導致

3、腦細胞水腫，損害神經(jīng)元。K-ATP通道開放劑克羅卡林(Cromakalin)以細胞內的ATP/ADP水平為門控因素、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道。K-ATP通道廣泛存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內，也存在小膠質細胞上，它的激活開放是機體缺血缺氧狀態(tài)下的自我保護機制，可以對抗損害因子對機體的傷害。目前有關K-ATP通道開放劑克羅卡林對腦缺血再灌注損傷的作用以及小膠質細胞、誘導型一氧化氮合酶表達等方面研究較少，機制不清楚。
　　 本研究采用大鼠大

4、腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，觀察大鼠急性腦缺血再灌注后神經(jīng)缺損改變、腦內海馬區(qū)小膠質細胞激活、誘導型一氧化氮合酶的表達情況，神經(jīng)元特異性尼氏染色法檢測海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目及K-ATP通道開放劑克羅卡林干預后的變化，為K-ATP通道開放劑盡早應用于臨床治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 1．實驗動物與分組：72只健康雄性SD大鼠，體重220±30g，隨機分為3組：A組為假手術組，B組為單純缺血再

5、灌注組，C組為克羅卡林干預組，每組24只分6h、24h、72h、7d，4個時間點，每個時間點各6只。
　　 2．動物模型制備：應用改良Zea Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型。大鼠蘇醒后參照Zea Longa5分制標準【3】進行神經(jīng)行為學評分：1-3分動物入選，，0、4分動物、開顱后發(fā)現(xiàn)腦蛛網(wǎng)膜下腔出血動物及再灌注后24小時之內死亡的動物棄之不用，隨機等量補齊按原方案重新造模進行。
　　 3．

6、動物處理：C組在MCAO后2h給予克羅卡林(0.4mg/kg/d)2ml腹腔注射。B組在MCAO后2h給予生理鹽水2ml腹腔注射。A組除了不插入線栓其他同B組。達到各時間點后，用10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用生理鹽水和4％多聚甲醛進行心臟灌注固定，取腦，制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4μm)。
　　 4．觀察指標：達各時間點大鼠處死前進行神經(jīng)功能缺損評分。采用免疫組化染色（SP法）檢測CA1區(qū)OX42（小膠質

7、細胞的標志）、iNOS的表達變化情況。各組取7d時間點進行海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色，每組取6張切片，在400倍視野下計數(shù)神經(jīng)元。
　　 5．統(tǒng)計學方法：實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x士s）表示，應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析( one-way, ANOVA)，均數(shù)間的兩兩比較采用LSD檢驗，以α=0.05作為顯著性檢驗水準。
　　 結果:
　　 1．動物神經(jīng)行為評分：A組大鼠

8、清醒后無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，B、C組大鼠在造模后再灌注6h清醒狀態(tài)下神經(jīng)功能缺損評分差異不明顯（P＞0.05）。在其他時間點B組與C組神經(jīng)功能缺損相比，C組神經(jīng)功能缺損較B組顯著減輕（P＜0.05）。
　　 2．免疫組化染色海馬CA1區(qū)OX42的表達情況：A組、B組、C組各個時間點海馬CA1區(qū)OX42均有表達，A組4個時間點OX42表達變化不明顯，B、C兩組6小時開始表達，24小時明顯增多，72小時達高峰，7天仍有表達，明顯高

9、于A組各時間點(P＜0.05)；C組各時間點OX42表達均少于B組(P＜0.05)。
　　 3．免疫組化染色海馬CA1區(qū)iNOS的表達情況：A組、B組、C組各個時間點海馬CA1區(qū)iNOS均有表達；A組4個時間點iNOS表達變化不明顯；B、C兩組6小時開始表達，24小時明顯增多，72小時達高峰，7天仍有表達，明顯高于A組各時間點(P＜0.05)；C組時間點iNOS表達均少于B組(P＜0.05)。
　　 4．神經(jīng)元尼氏染色：

10、A組神經(jīng)元60.66±6.62個，B組神經(jīng)元11.50±3.08個，C組神經(jīng)元29.33±4.88個，三組之間差異明顯，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1．急性腦缺血再灌注損傷后可引起大鼠海馬CA1區(qū)小膠質細胞激活，誘導性一氧化氮合酶表達增多，并隨著再灌注時間延長增強，對腦組織產生損害作用。
　　 2．克羅卡林可抑制海馬CA1區(qū)小膠質細胞激活，抑制誘導性一氧化氮合酶表達，減少缺血再灌注對腦組織